GLI1在結(jié)腸癌中表達(dá)及與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

林智平 段 炤 熊萍香 黃捷平 梅瑞平 楊德平

1.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科，江西南昌 330006；2.江西省兒童醫(yī)院內(nèi)科，江西南昌 330006

結(jié)腸癌（colonic cancer）是嚴(yán)重危害人類健康的惡性腫瘤，居全球癌癥死亡最常見原因第三位，每年約有100萬新發(fā)病例和超過60萬的死亡病例[1]。早期結(jié)腸癌無明顯癥狀，晚期主要表現(xiàn)為排便性質(zhì)改變、腸梗阻及腸外轉(zhuǎn)移等[2]。發(fā)生轉(zhuǎn)移后患者的5年生存率＜10%。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal-transformation，EMT）是指上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。EMT是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟之一，Vimentin、N-cadherin表達(dá)上調(diào)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂星忠u特性的間質(zhì)型腫瘤細(xì)胞。Hedgehog/GLI1信號(hào)通路涉及多種人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展，其異常活化已經(jīng)被證實(shí)與結(jié)腸癌密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組化檢測GLI1、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin在結(jié)腸癌及對應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)，探討GLI1表達(dá)與結(jié)腸癌EMT的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月～2015年12月江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃鏡下所取的50例結(jié)腸癌病理標(biāo)本及其50例癌旁組織，病理標(biāo)本均未接受過放療、化療，病理組織檢查確診為結(jié)直腸癌，其中女12例，男38例；分化程度：低分化21例，中高分化29例；TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期17例，Ⅲ+Ⅳ期33例；淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組38例，無轉(zhuǎn)移組12例。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理研究會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑

抗兔抗人GLI1多克隆抗體、鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人N-cadherin單克隆抗體、鼠抗人E-cadherin單克隆抗體、防脫掛膠玻片、蘇木精染色液、SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒、中性樹膠均購自武漢博士德公司，所有檢測過程嚴(yán)格按照試劑盒操作說明進(jìn)行。

1.3 實(shí)驗(yàn)過程

將石蠟切片置烤箱內(nèi)30 min。經(jīng)二甲苯三缸，加乙醇，入蘇木精，入飽和碳酸鋰溶液，伊紅染色，二甲苯透明，中性樹膠封片。石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS沖洗3次。蘇木素復(fù)染，PBS沖洗返藍(lán)。用新鮮配制的DAB顯色，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固。GLI1主要表達(dá)于細(xì)胞漿及胞核，陽性細(xì)胞＜20%為陰性，≥20%為陽性[4]。 Vimentin、N-cadherin[5]、E-cadherin[6]主要表于達(dá)細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中，陽性細(xì)胞＜10%為陰性，≥10%為陽性。參考Rosano[7]的方法，EMT陽性為Vimentin表達(dá)陽性，N-cadherin表達(dá)陽性而E-cadherin表達(dá)陰性，將這一組標(biāo)記為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；GLI1表達(dá)與Vimentin、N-cadherin、E-cadherin 的表達(dá)情況以及與臨床病理因素的關(guān)聯(lián)性采用多因素分析，GLI1與EMT的關(guān)系采用Kendall tau-b相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GLI1、Vimentin、N-cadherin 及 E-cadherin 表達(dá)及與病理參數(shù)的關(guān)系

GLI1在癌旁組織中的表達(dá)率為30%（15/50），低于結(jié)腸癌組織[78%（39/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GLI1陽性表達(dá)率與結(jié)腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化明顯相關(guān)（P＜0.05），與性別、腫瘤大小無明顯關(guān)系（P＞0.05）。Vimentin在癌旁組織中的表達(dá)率為 16%（8/50），低于結(jié)腸癌組織[58%（29/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Vimentin的表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤分化、TNM、及淋巴是否轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）。N-cadherin在癌旁組織中的表達(dá)率為12%（6/50），低于結(jié)腸癌組織[46%（23/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。N-cadherin的表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤分化、TNM、及淋巴是否轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）。E-cadherin在癌旁組織中的表達(dá)率為92%（46/50），高于結(jié)腸癌組織[30%（15/50）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。 E-cadherin 的表達(dá)與結(jié)腸癌的腫瘤分化、TNM、及淋巴是否轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)（P＜0.05）（表1）。

表1 GLI1、Vimentin、N-cadherin、E-cadherin 在結(jié)腸癌中的表達(dá)（例）

2.2 結(jié)腸癌組織中GLI1與EMT的關(guān)系

在50例結(jié)腸癌中，EMT陽性表達(dá)率為36%，Kendall tau-b相關(guān)分析提示，GLI1與EMT的狀態(tài)成正相關(guān)（P＜0.05）（表2）。

表2 GLI1與EMT的關(guān)系（例）

3 討論

EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象[8]。上皮細(xì)胞失去極性，經(jīng)過細(xì)胞骨架重塑，轉(zhuǎn)變成具有遷移能力的間質(zhì)表型過程。其過程伴隨著E-cadherin、角蛋白等上皮標(biāo)志物的減少和Vimentin、纖維連接素、N-cadherin等間質(zhì)標(biāo)志物的增加[2]。E-cadherin主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，通過增加腫瘤細(xì)胞的黏附能力抑制腫瘤細(xì)胞侵襲。N-cadherin主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞，通過使腫瘤細(xì)胞結(jié)合于間質(zhì)成分促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲[9]。EMT可以增強(qiáng)癌癥的侵襲，促進(jìn)癌癥的發(fā)展。曾祥岳等[10]的研究結(jié)果顯示，檢測E-cadherin、Vimentin表達(dá)情況能評估腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在危險(xiǎn)性，有助于對結(jié)直腸癌腫瘤細(xì)胞增殖能力、分化程度、惡性擴(kuò)散潛能及患者預(yù)后進(jìn)行判斷。本研究結(jié)果提示，E-cadherin在癌旁組織中的表達(dá)率高于結(jié)腸癌組織，與結(jié)腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化明顯有關(guān)；Vimentin、N-cadherin在結(jié)腸癌中的表達(dá)率高于癌旁組織，與結(jié)腸癌的淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期、腫瘤分化明顯有關(guān)。本研究結(jié)果提示，結(jié)腸癌的發(fā)生與Vimentin、N-cadherin上調(diào)及E-cadherin下調(diào)有關(guān)，與曾祥岳等[10-12]的研究結(jié)果相符。

GLI1能夠激活SHH通路下游基因轉(zhuǎn)錄和翻譯，其發(fā)生突變或者表達(dá)上調(diào)時(shí)會(huì)引起多種調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移的基因和生長因子轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平改變，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[13]。近期眾多研究發(fā)現(xiàn)，GLI1參與各種腫瘤的發(fā)生過程。彭友[14]的研究顯示，GLI1蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于對應(yīng)的癌旁組織，GLI1在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和高T分期的結(jié)腸癌組織中顯著高表達(dá)，且GLI1是結(jié)腸癌患者術(shù)后無轉(zhuǎn)移生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。柳青峰[15]的研究也顯示GLI1能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其研究 GLI1和 EMT相關(guān)蛋白 MMP9、E-cadherin和Vimentin在胰腺癌中的表達(dá)相關(guān)性及臨床病理學(xué)意義。竇連峰等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，GLI1表達(dá)上調(diào)可能在肺癌早期的發(fā)生過程中起作用。鄭建濤等[17]證實(shí)GLI1及Foxml水平對胃癌轉(zhuǎn)移狀況及治療預(yù)后有影響。魏凌云等[18]發(fā)現(xiàn)GLI1參與了食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展，與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。郭麗梅等[19]的研究顯示，GLI1蛋白表達(dá)的陽性比例和陽性信號(hào)越高，腫瘤的浸潤和侵襲行為越強(qiáng)，淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移的概率越高，TNM分期越高。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果相同。

GLI1蛋白的活化可能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[19]。GLI1蛋白上調(diào)導(dǎo)致ER蛋白、E-cadherin蛋白表達(dá)下調(diào)相關(guān)，從而誘導(dǎo)EMT的高度活化，乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移游走的能力得到增強(qiáng)后，更容易發(fā)生腋窩淋巴結(jié)的跳躍式轉(zhuǎn)移。乳腺癌中Hedgehog通路調(diào)節(jié)EMT過程的機(jī)制愈發(fā)明晰，靶向干涉或阻斷Hedgehog通路[20]，證實(shí)GLI1表達(dá)與EMT的狀態(tài)有關(guān)。

綜上所述，GLI1及 EMT中的Vimentin、N-cadherin、E-cadherin與結(jié)直腸癌患者的腫瘤分化程度、TNM臨床分期、淋巴是否轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且對患者轉(zhuǎn)移的預(yù)判具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。