雨生紅球藻軟膠囊安全性毒理學(xué)評價

王彥武 覃光球 何 勵 彭 亮 高玉秋 王紹龍

廣西壯族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心衛(wèi)生毒理所，廣西南寧 530028

雨生紅球藻（haematococcus pluvialis）是目前已知自然界中蝦青素（Astaxanthin）含量最豐富的生物[1]，可達(dá)干重的1.43%～3.51%[2]，被看作是天然蝦青素的“濃縮品”。研究顯示，蝦青素具有抗氧化[3-4]、抗腫瘤[5-6]、抗輻射[7]、抗炎[8-9]、增強(qiáng)免疫力[10]、調(diào)節(jié)血糖[11]等作用，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用較廣[12]。2010年10月，我國原衛(wèi)生部批準(zhǔn)雨生紅球藻為新資源食品，隨后市場上涌現(xiàn)出國產(chǎn)雨生紅球藻的不同劑型保健產(chǎn)品。本實驗對以雨生紅球藻為主要成分的某品牌雨生紅球藻軟膠囊進(jìn)行急性、遺傳毒性和大鼠30 d喂養(yǎng)試驗研究，旨在為雨生紅球藻及其產(chǎn)品開發(fā)提供安全性毒理學(xué)評價試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 受試物

北京某醫(yī)藥科技有限公司送檢的雨生紅球藻軟膠囊，內(nèi)容物為紫紅色油狀物，主要成分為雨生紅球藻油。人口服推薦用量為每人（成人）每日1次，每次1粒，成人體重按60 kg計算，折合劑量為6.7 mg/（kg·BW）。

1.2 實驗動物

廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供的SPF級健康昆明種小鼠120只及SPF級健康SD種大鼠80只，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號為44007200014053（小鼠）、44007200015 232（大鼠）。動物在實驗室屏障系統(tǒng)正常飼養(yǎng)3 d后使用，環(huán)境溫度為22～25℃，相對濕度為55%～70%。動物試驗倫理經(jīng)廣西疾病預(yù)防控制中心倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.3 儀器

全自動生化儀（日本Olympus AU400），全自動血球計數(shù)儀（日本Sysmex XT2000i），全自動半薄切片機(jī)（德國Leica RM2265），全自動染色機(jī)（德國Leica ST5020），顯微鏡（德國Leica DM3000）。

1.4 方法

急性經(jīng)口毒性試驗、遺傳毒性試驗及大鼠30 d喂養(yǎng)試驗均參照 《食品安全性毒理學(xué)評價程序和方法》GB15193-2003的相關(guān)試驗方法[13]進(jìn)行。采用最大耐受劑量法（MTD）進(jìn)行小鼠急性經(jīng)口毒性試驗，SPF級健康昆明種小鼠20只，雌雄各半。按該軟膠囊內(nèi)容物 0.9 g/ml比重計算，劑量為 18 000 mg/（kg·BW），觀察動物的中毒表現(xiàn)和死亡情況；小鼠精子畸形試驗和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗均設(shè)10 000、5000、2500 mg/（kg·BW）3個劑量組和環(huán)磷酰胺陽性對照組及陰性對照組，每組動物10只。觀察小鼠精子畸形率及小鼠骨髓微核率，如出現(xiàn)明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系并有統(tǒng)計學(xué)意義，即確認(rèn)為陽性結(jié)果；大鼠30 d喂養(yǎng)試驗設(shè)670.0、335.0、167.5 mg/（kg·BW）3 個劑量組 （分別相當(dāng)于人體推薦劑量的100、50、25倍）和1個玉米油對照組，每組動物20只，雌雄各半。分籠飼養(yǎng)，記錄進(jìn)食量，灌胃量為 0.5 ml/（100 g·BW），連續(xù)灌胃 30 d 后試驗結(jié)束。處死大鼠，觀察血常規(guī)、血清生化學(xué)指標(biāo)和病理檢查。病理組織學(xué)檢查時先對高劑量組和對照組動物的主要臟器進(jìn)行，如果發(fā)現(xiàn)病變后需對較低劑量組相應(yīng)的器官及組織制片檢查。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，小鼠精子畸形試驗數(shù)據(jù)采用秩和檢驗分析，骨髓細(xì)胞微核試驗數(shù)據(jù)采用泊松分布均數(shù)比較法分析，大鼠30 d喂養(yǎng)試驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析和組間比較。

2 結(jié)果

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗

給予受試物后連續(xù)觀察14 d，未見動物死亡，提示該雨生紅球藻軟膠囊 MTD＞18 000 mg/（kg·BW），急性經(jīng)口毒性分級屬無毒級。

2.2 遺傳毒性試驗

2.2.1 小鼠精子畸形試驗 受試物各劑量組與陰性對照組的小鼠精子畸形率在1.51%～1.72%之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組為5.28%，各劑量組動物精子畸形率與陰性對照組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示未見該受試物對雄性小鼠的精子產(chǎn)生致突變作用。

2.2.2 骨髓細(xì)胞微核試驗 受試物各劑量組與陰性對照組的微核發(fā)生率在0.8‰～1.4‰之間，環(huán)磷酰胺陽性對照組的微核發(fā)生率為24.4‰。各劑量組骨髓細(xì)胞微核率與陰性對照組相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），而陰性對照組與環(huán)磷酰胺陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示未見該受試物對小鼠的骨髓細(xì)胞有損傷和抑制作用。

2.3 大鼠30 d喂養(yǎng)試驗

試驗期間各組動物未見明顯中毒表現(xiàn)，大鼠生長發(fā)育良好，試驗結(jié)束時，無動物死亡。各劑量組大鼠終末體重、總增重、總進(jìn)食量、食物利用率、白細(xì)胞總數(shù)、血小板、紅細(xì)胞總數(shù)、血紅蛋白以及各項血清生化指標(biāo)與對照組比較接近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1～4）。各劑量組大鼠臟器重和臟體比值在正常值范圍內(nèi)，且與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表5）。

表1 受試物對大鼠體重、總增重、進(jìn)食量、食物利用率的檢查結(jié)果比較（±s）

表1 受試物對大鼠體重、總增重、進(jìn)食量、食物利用率的檢查結(jié)果比較（±s）

組別 初重（g） 終末重（g） 總增重（g） 總進(jìn)食量（g）總食物利用率（%）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組75.7±4.4 75.8±5.3 75.7±6.3 75.9±4.8 331.8±19.6 333.2±14.5 335.1±14.6 337.7±17.1 256.1±17.3 257.4±13.9 259.4±10.4 261.8±15.4 705.5±52.5 713.6±47.8 714.7±72.2 715.9±63.9 36.4±2.4 36.1±1.8 36.6±3.1 36.7±2.0 74.2±5.7 74.1±7.1 74.1±6.8 74.3±4.7 232.2±18.5 235.4±16.7 231.4±13.3 233.3±14.8 158.0±14.3 161.3±11.0 157.3±10.2 159.0±13.6 594.2±37.6 601.2±45.5 593.2±43.6 596.1±58.7 26.6±1.1 26.9±1.0 26.6±1.8 26.8±2.3

表2 受試物對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的檢查結(jié)果比較（±s）

表2 受試物對大鼠血常規(guī)指標(biāo)的檢查結(jié)果比較（±s）

性別 白細(xì)胞總數(shù)（×109/L）血小板（×109/L）紅細(xì)胞總數(shù)（×1012/L）血紅蛋白（g/L）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組8.18±0.84 8.27±1.18 8.16±0.53 7.93±1.11 858.7±87.2 854.7±174.7 832.2±153.9 851.8±173.0 7.27±0.48 7.59±0.87 7.36±0.81 7.54±0.66 144.2±9.3 148.6±18.4 144.2±17.2 146.9±12.3 8.17±1.19 8.59±1.30 8.27±0.91 8.63±0.90 874.3±122.1 834.6±125.2 878.2±118.5 850.3±139.9 7.34±0.61 7.54±0.70 7.20±0.53 7.55±0.70 142.6±11.6 147.9±15.2 140.9±10.6 146.0±14.4

2.4 病理學(xué)檢查

所有動物進(jìn)行大體檢查，均未發(fā)現(xiàn)明顯病變。對受試物的670.0 mg/（kg·BW）劑量組和陰性對照組動物的主要臟器進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，結(jié)果見圖1。大鼠的肝小葉組織可見肝細(xì)胞輕度脂肪變性（劑量組有3只、玉米油對照組有4只），可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死（劑量組有1只、玉米油對照組有1只），大鼠的肝臟匯管區(qū)可見少量炎細(xì)胞浸潤（劑量組有1只、玉米油對照組有2只）；大鼠的腎臟皮質(zhì)部間質(zhì)可見少量炎細(xì)胞浸潤（劑量組有2只、玉米油對照組有2只）。以上兩組動物組織病變輕且病程相似，故可以排除與受試物相關(guān)。動物的其他臟器脾、胃、十二指腸、睪丸及卵巢等組織未見病理組織學(xué)改變，提示該受試物對大鼠的上述臟器組織無損害作用。

表3 受試物對大鼠血液生化指標(biāo)的檢查結(jié)果比較（±s）

表3 受試物對大鼠血液生化指標(biāo)的檢查結(jié)果比較（±s）

性別 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（U/L）丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（U/L）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組130.0±13.4 128.7±13.1 134.7±9.0 133.9±10.3 44.0±5.1 47.8±3.4 42.5±6.6 47.2±9.1 6.21±0.52 6.14±0.61 6.12±0.74 5.98±0.89 43.5±5.0 43.9±3.9 44.2±4.3 41.1±5.1 133.4±14.5 136.9±14.4 137.2±14.0 131.6±15.4 45.3±6.4 46.1±8.3 44.9±4.3 44.7±5.8 5.96±0.64 6.13±0.50 6.10±0.61 6.05±0.30 45.6±5.2 41.7±7.0 43.3±5.3 45.1±6.5

表4 受試物對大鼠血液生化指標(biāo)的檢查結(jié)果比較（±s）

表4 受試物對大鼠血液生化指標(biāo)的檢查結(jié)果比較（±s）

性別 膽固醇（mmol/L）三酰甘油（mmol/L）總蛋白（g/L）白蛋白（g/L）血糖（mmol/L）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組2.19±0.28 2.35±0.40 2.16±0.45 2.23±0.36 0.96±0.27 0.97±0.29 1.06±0.16 1.04±0.34 67.2±4.7 67.5±8.6 68.2±6.2 67.1±7.0 32.0±3.5 31.7±5.8 32.8±4.6 33.1±3.8 5.82±0.67 5.91±0.44 5.77±0.50 5.71±0.51 2.28±0.35 2.22±0.30 2.14±0.47 2.34±0.30 0.99±0.46 0.98±0.40 1.13±0.34 1.10±0.20 67.9±4.2 66.6±7.6 66.1±7.3 66.9±5.8 32.6±4.3 33.4±3.1 32.0±2.1 32.6±3.0 5.56±0.40 5.96±0.70 5.81±0.85 5.75±0.30

表5 受試物對大鼠臟器重量和臟器/體重比的檢查結(jié)果（±s）

表5 受試物對大鼠臟器重量和臟器/體重比的檢查結(jié)果（±s）

性別 肝臟濕重（g） 肝體比（%）雄性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組雌性組（n=10）670.0 mg/kg 335.0 mg/kg 167.5 mg/kg玉米油對照組9.93±1.26 9.79±0.95 9.88±0.89 9.99±1.08 3.10±0.44 3.03±0.28 3.04±0.29 3.05±0.37 6.86±0.38 7.13±0.46 7.02±0.52 6.98±0.72 3.07±0.33 3.14±0.33 3.14±0.27 3.09±0.28腎臟濕重（g） 腎體比（%）2.53±0.40 2.55±0.22 2.63±0.30 2.59±0.20 0.78±0.11 0.79±0.07 0.81±0.09 0.79±0.07 1.78±0.24 1.82±0.33 1.78±0.24 1.77±0.18 0.80±0.10 0.80±0.14 0.80±0.12 0.79±0.08脾臟濕重（g） 脾體比（%）0.75±0.07 0.72±0.08 0.74±0.09 0.73±0.08 0.23±0.03 0.22±0.02 0.23±0.03 0.22±0.03 0.51±0.04 0.50±0.05 0.53±0.06 0.51±0.05 0.23±0.03 0.22±0.03 0.24±0.03 0.23±0.02睪丸濕重（g） 睪體比（%）3.13±0.31 3.06±0.35 3.15±0.39 3.06±0.37 0.97±0.07 0.95±0.09 0.97±0.12 0.94±0.13

圖1 大鼠的肝臟和腎臟組織病理學(xué)改變（HE染色）

3 討論

國內(nèi)外對紅球藻毒性研究報道中的劑型各有不同[14-18]。蝦青素是一種天然的類胡蘿卜素，分子式為C40H52O4與β-胡蘿卜素相似[19-20]。類胡蘿卜素不溶于水，溶于脂肪和脂肪溶劑，因此雨生紅球藻做成軟膠囊劑型的保健品，對人體吸收利用較為合理。

本試驗中，雨生紅球藻軟膠囊最大給藥劑量達(dá)18 000 mg/（kg·BW）下，未見動物有中毒癥狀和死亡，急性經(jīng)口毒性為無毒級，反映體內(nèi)生殖細(xì)胞和體細(xì)胞遺傳毒性試驗的小鼠精子畸形試驗和小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗結(jié)果均為陰性。30 d喂養(yǎng)試驗中，大鼠生長發(fā)育良好，總增重、進(jìn)食量、食物利用率、血常規(guī)和血液生化等指標(biāo)等均未受明顯影響。組織病理學(xué)檢查大體解剖正常，鏡下觀察到的病變屬動物的自發(fā)輕型病變，提示該雨生紅球藻軟膠囊未見產(chǎn)生毒副作用。

雨生紅球藻為新資源食品，遺傳毒性試驗還應(yīng)兼顧原核和真核細(xì)胞、體內(nèi)和體外試驗相結(jié)合的原則增加Ames試驗、V79/HGPRT基因突變試驗、程序外DNA修復(fù)合成（UDS）試驗，為進(jìn)一步觀察其長期毒性作用，可進(jìn)行90 d喂養(yǎng)試驗、繁殖試驗、代謝試驗等研究。