神經生長因子及其低親和力受體誘導肝星狀細胞凋亡的初步研究

朱海燕 吳雄健 曾 斌 謝志軍

贛南醫學院第一附屬醫院消化內科，江西贛州 341000

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化是慢性肝病進展的中心環節[1-2]，人及大鼠的HSC都可表達低親和力受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR），當神經生長因子（nerve growth factor，NGF）與p75NTR結合時可誘導細胞凋亡[3]。本研究主要探討NGF及p75NTR影響HSC增殖及凋亡的可能作用機制，尋找防治肝纖維化的新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

NGF及p75NTR購自美國RD公司；AnnexinⅤ-FITC購自美國羅氏公司；P53 and Caspase-3抗體購自武漢博士德公司；S-P超敏試劑盒（鼠/兔）及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；DMEM培養液及胎牛血清購至美國Gibco公司。HSC系HSC-T6由上海中醫藥大學徐列明教授提供，系SV40轉染后的大鼠HSC，具有活化HSC表型。

1.2 方法

1.2.1 HSC-T6的培養與傳代 使用DMEM培養液（含100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素，10%胎牛血清）進行培養。設定培養溫度37℃，CO2濃度5%，濕度飽和。于隔天進行一次換液。待細胞密度達80%～90%，以0.02%EDTA和0.25%胰蛋白酶分散細胞，按1∶4傳代。將其分為對照組、NGF組和NGF+p75NTR組，對照組采用0 ng/ml NGF+0 ng/ml p75NTR，NGF組采用100 ng/ml NGF，NGF+p75NTR 組 采 用 100 ng/ml NGF+100 ng/ml p75NTR。

1.2.2 NGF及p75NTR對HSC-T6增殖的作用 取對數生長期細胞，細胞懸浮液濃度調至7×104/ml，接種于96孔板中，每孔200 μl，24 h后棄上清，加入各濃度NGF，三組各設4個復孔，培養24 h，而后將預配的XTT比色液50 μl分別加入各孔，置于培養箱中再孵育4 h。使用酶標儀測定吸光值（OD值），設定主波長570 nm，參考波長690 nm。

1.2.3 NGF及P75NTR對HSC-T6凋亡的影響 取對數生長期細胞，細胞懸液濃度調至5×105/ml，接種于T-25培養瓶中，24 h后按照分組各培養24 h，收取所有細胞，取1×106洗滌細胞，加入100 μl的結合緩沖液，再加AnnexinⅤ-FITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2 μl，在室溫下避光染色30 min，然后再添加結合緩沖液300 μl，以流式細胞儀檢測HSC凋亡。

1.2.4 P53及Caspase-3表達的測定 取對數生長期細胞，細胞懸液濃度調配至7×104/ml，滴于預先處理好的置于六孔板內的蓋玻片上，每孔0.4 ml，孵育24 h，分組后繼續培養24 h，然后以4%多聚甲醛固定細胞，分別使用P53及Caspase-3一抗，應用SP法進行免疫細胞化學染色，DAB顯色，蘇木精復染，二甲苯透明，中性樹脂封片，在光學顯微鏡下胞膜或胞漿或胞核呈棕黃色的為陽性細胞。每張切片在400×光鏡視野下共取10個視野，計數各自陽性細胞所占比例。以各陽性細胞的百分數來表示相應蛋白的陽性表達率。

1.3 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組數據間的比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況比較

各組與HSC-T6作用24h后，對照組OD值為0.73±0.01，高于NGF組的0.65±0.03及NGF+p75NTR組的0.40±0.04，差異有統計學意義（P＜0.05）；NGF 組與NGF+p75NTR組對HSC的增殖抑制作用比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 各組細胞凋亡情況比較

各組與HSC-T6作用24 h后，流式細胞術檢測結果顯示，對照組凋亡率[（6.88±1.35）%]低于 NGF 組和 NGF+p75NTR 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；NGF+p75NTR 組的凋亡率為（37.69±2.30）%，較 NGF 組凋亡率[（26.36±8.51）%]明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）（圖 1）。

圖1 NGF及p75NTR誘導肝星狀細胞凋亡的流式細胞術觀察

2.3 P53及Caspase-3蛋白的表達的變化

各組與HSC-T6作用24 h后，NGF組和NGF+p75NTR組的P53、Caspase-3表達與對照組比較有明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），其中NGF+p75NTR組升高較NGF組明顯，差異 有統計學意義（P＜0.05）（表1，圖 2～圖 4）。

表1 NGF及p75NTR處理HSC后Caspase-3、P53表達陽性細胞率的比較（%）

圖2 P53細胞免疫化學染色結果（S-P法，400×）

圖3 Caspase-3細胞免疫化學染色結果（S-P法，400×）

圖4 空白對照組（S-P法，400×）

3 討論

肝纖維化是肝硬化的早期病理改變和必經階段，是由各種致病因素導致肝臟慢性損傷。目前的研究結果認為，各種致病因素損傷肝細胞后，Kupffer細胞被激活，分泌出多種細胞因子，共同作用于HSC，最終導致肝纖維化[4-6]。HSC的活化和增殖是肝纖維化發生、發展進程中的一個關鍵環節。活化HSC已成為防治肝纖維化的主要靶細胞之一，誘導活化HSC凋亡是防治肝纖維化的一個重要策略[7-9]。

NGF不僅可誘導骨髓間充質干細胞向肝細胞分化，還可阻斷四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化，減輕肝組織炎癥[10-11]，NGF需通過p75NTR介導才可誘導細胞凋亡[12]。p75NTR介導的凋亡機制與多種細胞因子、激酶有關，其中絲裂原相關的蛋白激酶（MAPK）、半胱天冬酶（Caspase）等作用重要。研究發現肝臟受損的情況下肝細胞可表達NGF，用重組體NGF培養HSC，細胞凋亡明顯增多，且具有劑量依賴性，該作用可能通過調節NF-κB活性及PI3K/AKT信號通路而實現[13-15]。Caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應分子，常被作為研究細胞凋亡的關鍵分子[16]。在P53缺乏時，肝損傷產生更少的衰老細胞，并相應增加了HSCs的激活、細胞外基質沉積和間質纖維化[17]。作者前期研究結果也顯示，經NGF作用的大鼠HSC，可抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡及抑制HSC合成Ⅰ、Ⅲ型膠原[18-19]。NGF誘導細胞凋亡可能與使凋亡相關基因Caspase-3、P53表達上調，Bcl-2表達下調有關[20]。NGF聯合p75NTR的作用特點為針對不同靶細胞可能分別或共同發揮兩種相反的作用，誘導凋亡或促進存活。在既往研究中，多為分別觀察HSC中NGF或p75NTR的表達改變，有關研究結果甚至有相互矛盾之處，多認為NGF或p75NTR對HSC具有誘導凋亡的作用。本研究在既往研究基礎上，加入p75NTR及NGF共同作用于HSC，結果顯示NGF＋p75NTR組相較單純NGF組對HSC的增殖抑制及誘導凋亡作用更加明顯，可進一步增加凋亡相關蛋白Caspase-3、P53的表達，提示NGF與其p75NTR對于HSC的增殖抑制及誘導凋亡具有協同作用，NGF可能通過p75NTR從而誘導HSC凋亡及抑制其增殖，機制可能與調節Caspase-3、P53的表達有關。

目前關于NGF如何誘導HSC凋亡機制研究較少，本研究結果希望對今后進一步研究NGF作用于HSC的相關分子機制提供前期實驗基礎，為防治肝硬化及肝纖維化提供新的路徑。