不同碳源條件下里氏木霉的分泌蛋白比較分析

夏俊

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌330096）

纖維素是自然界中最豐富的生物質(zhì)，是在生物產(chǎn)業(yè)中最具潛力的可再生和可持續(xù)能源[1-2]。木質(zhì)纖維素是由纖維素、半纖維素、果膠和木質(zhì)素組成的高聚物[3]，其多糖成分可被酶降解為單糖和可發(fā)酵性糖[4]。然而，木質(zhì)纖維素的應(yīng)用和發(fā)展因植物細(xì)胞壁的堅(jiān)固性而受到限制。de Souza等[5]人發(fā)現(xiàn)，甘蔗組織由約30%的纖維素、60%的半纖維素以及10%的果膠和木質(zhì)素組成。對木質(zhì)纖維素生物合成機(jī)制的研究表明，來自27個(gè)家族的356種糖基轉(zhuǎn)移酶被預(yù)測參與細(xì)胞壁多糖糖苷鍵的形成[6]。因此，切斷多糖糖苷鍵需要不同的糖苷水解酶。

至今已報(bào)道有多種真菌具有降解木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的能力。里氏木霉（Trichoderma reesei）是一種可高效生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶并協(xié)同降解木質(zhì)纖維素的絲狀真菌，它可產(chǎn)生大量纖維素酶以水解纖維素及其衍生物中的β-1,4糖苷鍵，產(chǎn)生的葡萄糖為真菌提供易于生長的碳源[7]。因?qū)ζ渖飸?yīng)用的關(guān)注，里氏木霉中最豐富的纖維水解酶已成為結(jié)構(gòu)和遺傳研究的對象[8-9]，包括兩種纖維二糖水解酶（Cel7A和Cel6A，E.C. 3.2.1.91）、五種內(nèi)切葡聚糖酶（Cel7B、Cel5A、Cel12A、Cel61A和Cel45A，EC 3.2.1.4）以及兩種β-葡萄糖苷酶（BglI和BglII，EC 3.2.1.21）[10]。里氏木霉的半纖維素降解系統(tǒng)也由很多種酶組成，包括內(nèi)切-1,4 -β-木聚糖酶（XYNI, 2, 3和4, EC 3.2.1.8）、甘露聚糖（MANI，EC 3.2.1.78）、乙酰聚木糖酯酶（AXEI，EC 3.1.1.72）、α-半乳糖苷酶（BGAI，EC 3.2.1.22）和阿拉伯呋喃糖苷酶（ABFI，EC 3.2.1.55）[11-12]。

研究表明，特異蛋白的mRNA表達(dá)水平與其實(shí)際表達(dá)水平?jīng)]有明顯的相關(guān)性[13]。因此，在蛋白質(zhì)組學(xué)水平研究真菌的降解能力具有更大的現(xiàn)實(shí)意義。在過去的幾十年，由于基因組數(shù)據(jù)的增加以及蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為組學(xué)研究的必要組成部分[14]。同時(shí)，蛋白質(zhì)組學(xué)在絲狀真菌降解木質(zhì)纖維素的研究中也發(fā)揮了重要作用，進(jìn)一步闡明了高效降解復(fù)雜底物所需的完整酶系。在轉(zhuǎn)錄水平上，里氏木霉的基因表達(dá)受到不同碳源的調(diào)控[15]，但在分泌組水平上的相關(guān)研究還比較缺乏。本研究旨在分析和比較不同碳源條件下里氏木霉中分泌的纖維素降解蛋白，為合理、高效地轉(zhuǎn)化由特定多糖組成的木質(zhì)纖維素生物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基配方

無機(jī)鹽溶液：NaNO36 g/L，KH2PO41.5 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，ZnSO4?7H2O4.4 g/L，MnCl2?4H2O 1.0 g/L，CoCl2?6H2O0.32 g/L，CuSO4?5H2O0.315 g/L，CaCl2?2H2O1.47 g/L，F(xiàn)eSO4?7H2O1 g/L。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂 15g/L。

玉米麥麩培養(yǎng)基（CSWB）：玉米秸稈粉與麥麩以6∶4比例混合，每100g混合物粉末加200mL無機(jī)鹽溶液用于固態(tài)發(fā)酵。

甘蔗渣培養(yǎng)基（SEB）：甘蔗渣用壓力為14kg/cm2蒸汽處理8min，用去離子水洗滌直至無還原糖殘留，然后40℃干燥數(shù)天。每100g甘蔗渣加200mL無機(jī)鹽溶液用于固態(tài)發(fā)酵。

甘蔗秸稈培養(yǎng)基（SC）：將甘蔗秸稈粉碎成2mm左右的粉末，80%乙醇洗滌6遍再用去離子水洗除乙醇，干燥。每100g甘蔗秸稈加200mL無機(jī)鹽溶液用于固態(tài)發(fā)酵。

1.2 固態(tài)發(fā)酵與樣品收集

里氏木霉Rut-C30在PDA培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，產(chǎn)孢后收集孢子懸浮于無菌水中，濃度約為7.0×107/mL。分別取200μL孢液接種于含30gCSWB培養(yǎng)基、SEB培養(yǎng)基和SC培養(yǎng)基的三角瓶中并于30℃培養(yǎng)5天后收集樣品。向固體培養(yǎng)物中加入100mL無菌水并在4℃、200 r/min條件下萃取1h，隨后將混合液10000r/min離心20min，保存上清液至4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）分析分泌組蛋白

培養(yǎng)5天后的胞外粗酶液通過超濾作用收集，再利用三氯乙酸沉淀，所得蛋白粉用雙蒸水溶解。測定蛋白質(zhì)濃度后，將10μL蛋白質(zhì)含量小于100μg的蛋白質(zhì)溶液加入到50μL含0.5 mol/LTris-HCl、2.75 mmol/L EDTA和6 mol/L鹽酸胍的變性緩沖液中，然后將蛋白用1mol/L二硫蘇糖醇還原處理2 h，再用1mol/L碘乙酰胺50μL黑暗中烷基化處理1 h。離心后加入360 μL 25 mmol/L的NH4HCO3，按1∶25（w/w）加入胰蛋白酶，于37℃下水浴中酶切過夜，用Sep-Pak C18柱脫鹽后，將多肽樣品溶解于含50%乙腈和0.1%三氟乙酸的水溶液中。

肽段的分析通過液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用完成。反相色譜柱采用MagicTMC18柱（75 μm ×10 cm，3 μm）。流動(dòng)相A液為含2.0%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)甲酸的水溶液，流動(dòng)相B液為98%(v/v)乙腈和0.1%(v/v)甲酸的水溶液。2%～98%流動(dòng)相B梯度洗脫流速0.3 μL/ min。質(zhì)譜條件：噴霧電壓2 kV，毛細(xì)管溫度275 ℃，掃描范圍400～1800 m/z，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間60 s，質(zhì)量數(shù)據(jù)由軟件Xcalibur 2.2.0采集處理。每個(gè)樣品進(jìn)行三次技術(shù)重復(fù)。

1.4 質(zhì)譜數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫搜索

采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer software 1.4軟件根據(jù)SEQUEST算法搜索里氏木霉的蛋白數(shù)據(jù)庫（http://www.uniprot.org）。數(shù)據(jù)庫搜索條件為：（1）胰蛋白酶漏切位點(diǎn)為2；（2）肽段碎片最大質(zhì)量誤差為0.8 Da；（3）蛋氨酸氧化作為動(dòng)態(tài)修飾，半胱氨酸殘基的氨基甲酰作為固定修飾物；（4）肽段匹配假陽性率為1%；（5）至少有6個(gè)堿基有95%以上確定性（q≤0.05）。

使用無標(biāo)記的定量方法，通過肽譜匹配（PSMS）對蛋白質(zhì)的相對豐度進(jìn)行表征。所有蛋白質(zhì)均使用SigalP 4.1預(yù)測分泌信號(hào)。

2 結(jié)果與分析

經(jīng)篩選后，CSWB、SEB和SC三種培養(yǎng)基中的T. reesei分別含有分泌蛋白199、161、183個(gè)。如圖1所示，分泌蛋白可分為纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、酯酶、淀粉酶、蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶以及其他糖苷水解酶和一些未知功能的酶。T. reesei在三種培養(yǎng)基中的纖維素酶含量相近，CSWB和SC中的半纖維素酶含量比SEB高，但果膠酶含量都比SEB少。另外，半纖維素酶又可以分為木聚糖酶、1,3-1,4-β-葡聚糖酶、木葡聚糖酶和甘露聚糖酶等。T. reesei在三種培養(yǎng)基中的木葡聚糖酶含量相近，在CSWB和SC中分泌的木聚糖酶比SEB多，在CSWB中的1,3-1,4-β-葡聚糖酶比SEB和SC少。T. reesei在CSWB中分泌的甘露聚糖酶最多，其次是SC，而SEB中沒有發(fā)現(xiàn)甘露聚糖酶。

2.1 與纖維素降解相關(guān)的酶

纖維素的完全降解需要外切葡聚糖酶（纖維二糖水解酶，CBHs）、內(nèi)切葡聚糖酶（EGLs）、β-葡萄糖苷酶（BGLs）和其他輔助酶的協(xié)同作用。如表1所示，在CSWB、SEB和SC中均找到2種外切葡聚糖酶。在CSWB和SC中分別發(fā)現(xiàn)有3種和2種內(nèi)切葡聚糖酶，而SEB中沒有，但SEB中有4種β-葡萄糖苷酶，比CSWB和SC多。另外，多糖單加氧酶和膨脹素在CSWB中都發(fā)現(xiàn)有2種，在SEB和SC中都只有1種。

表1 各培養(yǎng)基中T. reesei分泌的纖維素降解酶數(shù)量

圖1 不同培養(yǎng)基中T. reesei分泌組蛋白分類

2.2 與1,3-1,4-β-葡聚糖降解相關(guān)的酶

1,3-1,4-β-葡聚糖的完全降解需要破壞β-1,3和β-1,4糖苷鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，T. reesei在SC中分泌較多的1,3-1,4-β-葡聚糖酶，包括1個(gè)1,4-β-D-內(nèi)切葡聚糖酶、1個(gè)1,3-β-外切葡聚糖酶和2個(gè)1,3-β-葡糖苷酶。而在CSWB中只找到1個(gè)1,4-β-內(nèi)切葡聚糖酶（表2）。

2.3 與木聚糖降解相關(guān)的酶

在CSWB和SC兩種培養(yǎng)條件下的T. reesei分泌蛋白中都檢測到了所有的主鏈酶（β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和β-木糖苷酶）和支鏈酶（阿拉伯糖苷酶、葡糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶），但在兩者中的含量有所差異（表2）。CSWB和SC中的T. reesei均含有2個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶和1個(gè)葡糖醛酸酶。另外，CSWB中T. reesei含1個(gè)β-木糖苷酶、2個(gè)乙酰木聚糖酯酶和2個(gè)阿拉伯糖苷酶，然與之相反，SC中的T. reesei卻含有2個(gè)β-木糖苷酶、1個(gè)乙酰木聚糖酯酶和1個(gè)阿拉伯糖苷酶。在SEB培養(yǎng)基中，只發(fā)現(xiàn)2個(gè)β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶、1個(gè)β-木糖苷酶和1個(gè)乙酰木聚糖酯酶，而沒有葡糖醛酸酶和阿拉伯糖苷酶。

2.4 與木葡聚糖降解相關(guān)的酶

木葡聚糖酶的完全降解依靠主鏈和支鏈酶的協(xié)同作用，包括一個(gè)降解主鏈的β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶和11個(gè)支鏈酶（α-木糖苷酶、α-巖藻糖苷酶、β-1,4-牛乳糖苷酶和α-阿拉伯糖苷酶）。在CSWB、SEB和SC三種培養(yǎng)基中的T. reesei都含有β-1,4-內(nèi)切葡聚糖酶，但除了在CSWB中含有1個(gè)β-1,4-牛乳糖苷酶外，三種培養(yǎng)基中都沒有發(fā)現(xiàn)其他參與降解木葡聚糖的酶。

2.5 與甘露聚糖降解相關(guān)的酶

降解甘露聚糖的主鏈酶和支鏈酶，包括2個(gè)β-1,4-內(nèi)切甘露糖酶、1個(gè)α-1,4-甘露糖苷酶和1個(gè)α-1,4-牛乳糖苷酶，都存在于CSWB培養(yǎng)基中；但SC中只有β-1,4-內(nèi)切甘露糖酶而SEB沒有任何參與甘露聚糖降解的酶（表2）。

表2 各培養(yǎng)基中T. reesei分泌的半纖維素降解相關(guān)酶的數(shù)量差異

3 討論

本文分析和比較了在玉米麥麩培養(yǎng)基、甘蔗渣培養(yǎng)基和甘蔗秸稈培養(yǎng)基三種不同碳源條件下里氏木霉中分泌的纖維素降解蛋白。結(jié)果表明，提供不同碳源時(shí)，里氏木霉中的酶表達(dá)差異較大。麥麩中含有45%～50%的纖維素、半纖維素等成分；甘蔗秸稈中大約含有59%的全纖維素和20%的木質(zhì)素；甘蔗渣的主要成分也是纖維素、半纖維素、木質(zhì)素，其中半纖維素大約20.6%、木質(zhì)素18.6%。纖維素在甘蔗渣里的含量大約為35.4%。因此，里氏木霉中的部分纖維素酶和半纖維素酶是誘導(dǎo)表達(dá)的，培養(yǎng)基中的不同碳源成分會(huì)誘導(dǎo)里氏木霉分泌所需的酶。