張利文，王艷玲

（沈陽工業大學遼陽分校 石油化工學院，遼寧沈陽 111003）

橘子類水果是全世界產量最大的水果，也是一種重要的經濟植物。皮渣作為其主要副產物，占柑橘總量的20%～40%，具有較大的利用價值[1]。柑橘皮中含有豐富的生物活性物質——黃酮類化合物，黃酮類藥物具有抗腦缺血、抗心肌缺血、抗心律失常、鎮痛、保肝護肝、抗病毒和抗腫瘤等作用[2]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 材料

橘皮、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、NaOH、蘆丁標準品、實驗室用蒸餾水。

1.1.2 主要儀器

紫外可見分光光度計（上海第三分析儀器有限公司）、水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責任公司）、三頻超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）、粉碎機（順德品科仕榮模具有限公司）、電子分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）、循環水抽濾泵（陜西太康生物科技有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上海市實驗儀器總廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的預處理

將橘皮置于60 ℃的恒溫干燥箱中干燥48 h，取出后用小型研磨機研磨，并且在80目篩上以得到干燥的橘皮粉末，備用。

1.2.2 標準曲線的繪制

1.2.2.1 蘆丁標準品溶液的制備

稱取0.015 g蘆丁標準品置于燒杯中加熱至60 ℃，并加入60%乙醇溶液，在超聲波儀器中溶解后，將其轉移到50.00 mL的容量瓶中，用60%乙醇水溶液稀釋至刻度，搖勻，得到濃度為0.30 mg/mL的蘆丁標準品溶液。

1.2.2.2 測定標準曲線

精密量取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL和6.00 mL蘆丁標準品溶液于25.00 mL容量瓶中，分別加入5%NaNO2溶液1.00 mL搖勻，靜置6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1.00 mL，6 min后加入4%NaOH溶液1.00 mL，最后用60%的乙醇水溶液定容，20 min后開始測量吸光度值。用蒸餾水溶液為空白對照，在最大吸收波長510 nm處測量吸光度值，以濃度為橫向坐標，吸光度值為縱坐標，繪制了蘆丁的標準曲線。蘆丁標準品濃度和吸光度的標準曲線如圖1所示。

圖1 蘆丁標準品的吸光度

1.2.3 總黃酮的提取

稱取1.00 g橘皮干粉，加入一定濃度的乙醇水溶液30 mL為提取劑，在一定溫度下加熱提取一定時間，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測定吸光度值，計算在不同的乙醇濃度比條件總黃酮的提取得率。

1.2.4 總黃酮的測定

在25.00 mL容量瓶中加入一定量的類黃酮提取液，并加入1.00 mL 5% NaNO2的溶液搖晃，放置6 min，再加入1.00 mL 10% Al(NO3)3溶液，6 min后加入4% NaOH溶液1.00 mL，再用60%乙醇水溶液定容至刻度，搖晃，靜置20 min，用紫外可見光光度計進行測量。

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對黃酮類化合物提取率的影響

稱取1.00 g橘皮干粉5份，分別加入50%、60%、70%、80%和90%乙醇水溶液30 mL為提取劑，在60 ℃下加熱提取20 min，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測定吸光度值，計算在不同的乙醇濃度比條件總黃酮的提取得率。結果見表1。

表1 乙醇水溶液濃度對提取效果的影響

由表1可知，乙醇濃度由50%增加至90%時,總黃酮含量隨之不斷增加，但80%時增長比較緩慢，原因是乙醇濃度過低時，橘皮中黃酮化合物不能完全溶解到溶液中，并且隨著乙醇濃度增大，溶解度增加，收率增加，但乙醇濃度太大時，黃酮被阻止進一步提取出來。因此選擇80%乙醇水為最佳濃度。

2.2 提取溫度對黃酮類化合物提取率的影響

稱取1.00 g橘皮干粉5份，加入60%乙醇水溶液30 mL為提取劑，在40、50、60、70 ℃和80 ℃下分別加熱提取20 min，抽濾，量取濾液體積，硝酸鋁顯色法配制溶液，測定吸光度值，計算在不同的溫度條件下總黃酮的提取得率，結果見表2。

表2 溫度對提取效果的影響

由表2可知，超聲溫度從40 ℃升高到80 ℃，橘皮中黃酮含量先增加后減少，在70 ℃時達到最大值。總黃酮含量減少的原因是當溫度過高時，由于強烈的熱效應而被破壞，有效成分被破壞，收率降低。因此，選擇70 ℃為超聲溫度。

2.3 提取時間對黃酮類化合物提取率的影響

稱取1.00 g橘皮干粉5份，加入60%乙醇水溶液30 mL為提取劑，在60 ℃下分別加熱提取10、20、30、40 min和50 min，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測定吸光度值，計算在不同時間條件下總黃酮的提取得率，結果見表3。

表3 加熱時間對提取效果的影響

由表3可知，隨著超聲時間的延長，總黃酮含量先增加后減少。原因可能是超聲時間短，類黃酮化合物不能完全溶解出來，所以產量低；隨著超聲時間的增加，黃酮全都溶解出來，收率增加；繼續延長超聲時間，超聲波產生大量的熱和空化效應，可能破壞了橘皮中黃酮的結構，最后得率降低。因此選擇水浴加熱時間40 min。

2.4 料液比對黃酮類化合物提取率的影響

稱取1.00 g橘皮干粉5份，分別加入60%乙醇水溶液10、20、30、40 mL和50 mL為提取劑，在60 ℃下加熱提取20 min，抽濾，量取濾液體積，按照硝酸鋁顯色法配制溶液，測定吸光度值，計算在不同的料液比條件下總黃酮的提取得率，結果見表4。

表4 料液比對提取效果的影響

表4表明，總黃酮含量隨著料液比的升高而升高，但料液比在一定比例后，總黃酮含量也隨之下降。原因可能是當料液比過小時，橘皮中黃酮類化合物不能完全溶解到于溶液中，所以得收率較低，隨著料液比過大時，溶解度增加，得率增加，但料液比過大時，溶解在溶液中的黃酮濃度被稀釋，收率反而降低。因此選擇1∶30為最佳料液比。

2.5 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平的正交試驗，確定乙醇濃度、料液比、超聲時間、提取溫度為研究因素，根據橘皮總黃酮收率，確定水浴加熱輔助提取總黃酮的最佳提取條件，因素水平見表5。

表5 總黃酮提取L9（34）因素、水平設計

按照正交試驗表操作，得數據如表6。

表6 正交試驗結果

由表6可看出，R極差B＞D＞A＞C，即料液比對產率影響最大，其次是溫度、乙醇濃度與提取時間。從K值大小可看出，正交試驗最優水平為A2B3C3D3，即提取溫度為75 ℃，乙醇濃度為80%、料液比為1∶35、提取時間為45 min。這個條件不在正交試驗的9次試驗中，為了確定試驗的可靠性，必須在此條件下進行驗證試驗。

2.6 最佳工藝條件驗證及結果

按照上述得出的最佳提取條件，對橘皮中黃酮提取液進行3次平行提取，測定提取物吸光度值，計算出平均得率，得率如表7所示。

表7 驗證試驗結果

由表7可知，3次平行提取試驗的平均產收率為2.19%，正交試驗表6中的最高的2.1%，說明該結果可靠。

3 結論

采用超聲波提取技術來提取橘皮中總黃酮，以乙醇作為提取溶劑，通過單因素試驗和正交試驗考察了乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度等因素對橘皮中總黃酮提取率的影響。優化后的超聲波輔助法提取橘皮總黃酮工藝參數為：提取溫度75℃、乙醇濃度80%、料液比1∶35、提取時間為45 min，此條件下得率為2.19%。