吳凱，魏趙延，李思慧，林偉強(qiáng)

（江蘇正大天創(chuàng)生物工程有限公司，江蘇泰州 225300）

葉酸是一種水溶性的B族維生素（維生素B9），為具有生物活性的葉酸鹽（folate）的前體，其在體內(nèi)的活性形式是5-甲基四氫葉酸，能傳遞一碳基團(tuán)（甲基或甲酰）給脫氧尿苷酸，使之變?yōu)槊撗跣剀账幔M(jìn)而合成DNA，是合成核酸、細(xì)胞生長和組織修復(fù)所必需的物質(zhì)，更是胚胎發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素。近年來大量研究已經(jīng)證實(shí)，葉酸是胎兒生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)素，有助于預(yù)防神經(jīng)管缺陷，包括脊柱裂和無腦兒等非常嚴(yán)重的出生缺陷的發(fā)生。葉酸的臨床功能除了預(yù)防胎兒神經(jīng)管缺陷外，還能降低孕婦妊娠高血壓、自發(fā)性流產(chǎn)和胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)以及新生兒低體重、唇腭裂、心臟缺陷等發(fā)病率。

亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylene Tetrahydrofolate Reductase，MTHFR）是細(xì)胞內(nèi)葉酸平衡和代謝的關(guān)鍵酶，在嘌呤和胸腺嘧啶存在的條件下不可逆催化5-甲酸基四氫葉酸合成5-甲基四氫葉酸，后者參與DNA的合成與甲基化作用。MTHFR基因常見的突變有兩種[1]：677位點(diǎn)C/T多態(tài)性與1 298位點(diǎn)A/C多態(tài)性。其中，C677T位點(diǎn)是到目前為止發(fā)現(xiàn)的MTHFR最為常見的突變位點(diǎn)，在中國的發(fā)生率為45.2%。研究表明[2-4]，677位點(diǎn)由C突變?yōu)門后，其編碼的丙氨酸被纈氨酸替代，導(dǎo)致MTHFR酶的熱穩(wěn)定性與酶活性降低，進(jìn)而會使同型半胱氨酸（Hcy）代謝受阻，在體內(nèi)積聚引起高同型半管氨酸血癥。高同型半管氨酸血癥與多發(fā)性流產(chǎn)、子癇前期、胎盤早剝、胎兒生長受限、胎兒畸形、死胎有關(guān)，且與早產(chǎn)密切相關(guān)。另外，1 298位點(diǎn)A變?yōu)镃后，谷氨酸被丙氨酸取代，同樣使MTHFR的酶活性下降，引起血漿同型半胱氨酸水平的升高和葉酸水平的降低，該位點(diǎn)在中國突變的頻率高達(dá)18.6%。

本研究通過建立一種簡單、準(zhǔn)確的快速檢測MTHFR基因多態(tài)性的試劑盒，為臨床指導(dǎo)孕婦服用葉酸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集來自泰州婦幼保健院的孕婦隨機(jī)靜脈血標(biāo)本100例，孕周2～36周。用真空采血管空腹采集各研究對象肘靜脈血3 mL，EDTA-K2抗凝，樣本置4 ℃保存。

1.2 儀器與試劑

7500實(shí)時熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾公司）；ST16R臺式高速冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾公司）；NanoDrop微量分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾公司）；血液DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）；GoldStarTaqMan Mixture（康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物、探針設(shè)計(jì)

通 過 NCBI數(shù) 據(jù) 庫（www.ncbi.nlm.nih.gov） 獲得MTHFR基因的全長編碼序列（GenBank：NM_005957.4），并進(jìn)一步找到對應(yīng)的基因組序列，用primerexpress 3.0軟件設(shè)計(jì)ARMS引物和探針，并根據(jù)人類基因組中相對保守的基因GAPDH基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物及熒光探針作為內(nèi)標(biāo)，引物及熒光探針由上海生工公司合成。檢測引物以及測序的引物序列見表1。

1.3.2 樣本擴(kuò)增及測序

構(gòu)建MTHFR-677和1298位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增總體系為 50μL，包括 GoldStar TaqMan Mixture 25μL，上、下游引物各1μL，基因組DNA 2μL，ddH2O補(bǔ)足至 50μL；PCR 循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35 個循環(huán)。取 10μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工公司進(jìn)行序列測定。根據(jù)測序結(jié)果，挑選出MTHFR基因677和1 298位點(diǎn)野生型和突變型樣本進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。

表1 MTHFR多態(tài)性位點(diǎn)及參考品品構(gòu)建所用引物探針

1.3.3 陽性參考品的構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)中的陽性參考品質(zhì)粒由上海捷瑞生物科技有限公司合成。將含有5 μg質(zhì)粒MTHFR-677-C、質(zhì)粒MTHFR-677-T、質(zhì)粒GAPDH、質(zhì)粒MTHFR-1298-A、質(zhì)粒MTHFR-1298-C、質(zhì)粒HBV溶于200 μL純化水中，并進(jìn)行梯度稀釋至10-5。將100μL 10-5質(zhì)粒MTHFR-677-C、100 μL純化水、100 μL 10-5質(zhì)粒GAPDH進(jìn)行混合成為MTHFR-677-CC型陽性參考品。將100 μL 10-5質(zhì)粒MTHFR-677-T、100 μL純化水、100 μL 10-5質(zhì)粒GAPDH進(jìn)行混合成為MTHFR-677-TT型陽性參考品。100 μL 10-5質(zhì)粒MTHFR-677-C、100 μL 10-5質(zhì) 粒 MTHFR-677-T、100 μL 10-5質(zhì) 粒GAPDH進(jìn)行混合成為MTHFR-677-CT型陽性參考品。 將 100 μL 10-5質(zhì) 粒 MTHFR-1298-A、100 μL純化水、100 μL 10-5質(zhì)粒GAPDH進(jìn)行混合成為MTHFR-1298-AA型陽性參考品。將100 μL 10-5質(zhì)粒 MTHFR-1298-C、100 μL純化水、100 μL 10-5質(zhì)粒GAPDH進(jìn)行混合成為MTHFR-1298-CC型陽性參考品。將100 μL 10-5質(zhì)粒MTHFR-1298-A、100 μL 10-5質(zhì)粒 MTHFR-1298-C、100 μL 10-5質(zhì)粒GAPDH進(jìn)行混合成為MTHFR-1298-AC型陽性參考品，陽性參考品的濃度為83 ng/μL。

1.3.4 熒光定量PCR擴(kuò)增和結(jié)果判讀

PCR反應(yīng)總體積為25 μL，包括2×TaqMan Mixture 12.5 μL，上、下游引物（ARMS引物、下游引物、內(nèi)標(biāo)正向引物、內(nèi)標(biāo)反向引物）各1 μ L，10 μmol/L檢測探針各0.5 μL，內(nèi)標(biāo)探針0.5 μL，基因組DNA 2 μL，并用 ddH2O 補(bǔ)足體積至 25 μL。檢測MTHFR-677位點(diǎn)和MTHFR-1298位點(diǎn)分別在2個PCR管中進(jìn)行。PCR循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 10 min；95 ℃115 s，60 ℃ 60 s，共40個循環(huán)。用7500 實(shí)時熒光定量PCR儀在60℃時收集熒光信號,熒光檢測通道設(shè)置時，2管均選擇FAM、VIC和ROX通道，淬滅基團(tuán)選擇“NFQ-MGB”。結(jié)果判讀：記錄每個檢測通道的Ct值，當(dāng)反應(yīng)的內(nèi)參通道（ROX）有擴(kuò)增曲線，且Ct＜30，但2管的FAM通道或者VIC通道均沒有擴(kuò)增曲線，可能為樣本DNA存在PCR抑制劑，應(yīng)重新取樣提取基因組DNA。樣品管進(jìn)行分析，按表2對MTHFR基因多態(tài)性進(jìn)行判定。

表2 結(jié)果判定表

2 實(shí)驗(yàn)與結(jié)果

2.1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

分 別 取 MTHFR-677-CC、MTHFR-677-TT、MTHFR-677-CT、MTHFR-1298-AA、MTHFR-1298-AC、MTHFR-1298-CC按照最佳反應(yīng)體系，分別進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，在同1天，同1批次每種型、每個濃度樣本各做10次檢測，批次1、批次2和批次3各重復(fù)檢測1次，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)。

重復(fù)性檢測結(jié)果見表3，4。結(jié)果表明，MTHFR-677位點(diǎn)和1298位點(diǎn)重復(fù)性檢測的CV值均處于較低水平。

表3 MTHFR-677位點(diǎn)重復(fù)性檢測結(jié)果

表4 MTHFR-1298位點(diǎn)重復(fù)性檢測結(jié)果

2.2 最低檢出限檢測及結(jié)果

以質(zhì)粒陽性參考品為模板，進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，分別取2 μL作為模板，用實(shí)時熒光定量PCR儀按照1.4.3的方法進(jìn)行檢測，確定該方法的最低檢出限。結(jié)果顯示，采用本方法測得的DNA濃度最低檢出限8.3×10-3ng/μL。詳見圖 1。

圖1 最低檢出限檢測結(jié)果

2.3 特異性檢測結(jié)果

利用NCBI數(shù)據(jù)庫的對實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物探針進(jìn)行系列比對表明，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的引物探針特異性良好。677位點(diǎn)引物與1298位點(diǎn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品交叉檢測無熒光信號產(chǎn)生，同樣1298位點(diǎn)引物檢測677位點(diǎn)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品無熒光信號產(chǎn)生。陰性對照（ddH2O）無熒光信號產(chǎn)生，整體特異良好。

2.4 臨床樣本檢測

按照血液DNA提取試劑盒說明書操作提取各研究對象的基因組DNA，取1 μL樣本用NanoDrop微量分光光度計(jì)檢測濃度及純度，濃度低于10 ng／mL或吸光度（A260/280）＜1.7的樣本需重新提取至合格為止。從合格的樣本中隨機(jī)選取50例樣本，并用本公司構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品的引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送上海生工公司用對MTHFR的677和1298位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析，其中MTHFR的677位點(diǎn)測序檢測為C表明樣本為野生型，為T則為突變型，同時存在C/T的雙峰則為雜合型；MTHFR的1298位點(diǎn)測序檢測為A表明樣本為野生型，為C則為突變型，同時存在C/A的雙峰則為雜合型。以評價本實(shí)驗(yàn)建立的方法與測序法結(jié)果的一致性。熒光PCR檢測結(jié)果示：MTHFR-677-CC 16例，MTHFR-677-CT 30例，MTHFR-677-TT 4例，MTHFR-1298-AA 33 例，MTHFR-1298-AC 15例，MTHFR-1298-CC 2例。

3 討論

本研究建立人MTHFR基因多態(tài)性的檢測方法結(jié)合了ARMS引物和TaqMan探針各自的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對突變樣本在的快速檢測和結(jié)果判斷。提供2管反應(yīng)同時檢測人類 MTHFR基因C677T位點(diǎn)和A1298C位點(diǎn)多態(tài)性的試劑盒，從對樣本核酸的提取到給出檢測結(jié)果，只需要2～3小時，同時還具有結(jié)果判讀簡單、檢測通量大、檢測成本低的優(yōu)點(diǎn)。試劑盒驗(yàn)證了最低檢出限，特異性和重復(fù)性等性能指標(biāo)，結(jié)果表明建立的方法能檢測8.3×10-3ng/μL濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。特異性實(shí)驗(yàn)表明MTHFR-677和1298位點(diǎn)各自的PCR 擴(kuò)增體系檢測對方的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品無交叉反應(yīng),整個實(shí)驗(yàn)體系不存在非特異性擴(kuò)增的問題。精密度試驗(yàn)結(jié)果表明其Ct的CV＜5%，表明重復(fù)性良好。

王蘇梅等[5]報道應(yīng)用TaqMan探針實(shí)時PCR檢測人MTHFR基因C677T多態(tài)性的方法，其方法是將MTHFR基因多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)在MGB探針的正中間，利用探針的特異性實(shí)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性的識別；然而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩者存在交叉檢測，極易導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確，另外一次只能檢測一個位點(diǎn)。

王佳等[6]使用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)快速檢測MTHFR基因多態(tài)性，但其采用的方法仍然需要通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定PCR結(jié)果，該方法的明顯缺點(diǎn)是存在電泳導(dǎo)致的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。測序法是檢測MTHFR基因多態(tài)性的金標(biāo)準(zhǔn)，但是操作耗時長且靈敏度低，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模推廣，與測序法相比本實(shí)驗(yàn)建立的方法優(yōu)勢明顯，探針靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)，2～3個小時內(nèi)即可得出結(jié)果，因此可以大規(guī)模運(yùn)用和推廣。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)尚存在不足之處，雖然本實(shí)驗(yàn)過程不存在PCR開蓋污染的可能，但是更安全的做法是在PCR擴(kuò)增體系中添加UNG酶（尿嘧啶-N-糖基化酶）和dUDP，以完全消除PCR擴(kuò)增產(chǎn)物對后續(xù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生污染的可能。