植物生長調節劑對貴州鎮遠野百合組織培養的影響

任峻，宋迎亞

（凱里學院大健康學院，貴州凱里 556011）

百合（Lilium brownii var. Viridulum）為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本球根植物，是一種集觀賞、食用、藥用、化妝為一體的花卉[1]。對于百合的組織培養始于20世紀50年代，Robb首先利用百合鱗片進行組織培養獲得成功[2]。我國在20世紀80年代初開展了百合的組織培養研究[3-5]，為百合組織培養研究奠定了基礎[2]。在組織培養技術之前，均采用傳統的鱗莖球繁殖方法，繁殖速度緩慢，特別是經多代繁殖以后，常造成種性退化，甚至病毒積累，影響百合的產量和質量[6]。實現百合種球組織培養是一項有效途徑[7]，既能縮短繁殖周期，增加繁殖系數，又能減少病毒侵害幾率[8]。可見，開展百合組織培養育苗工作十分必要。目前還沒有對產自貴州鎮遠的野百合的研究報道，本研究以貴州鎮遠百合鱗片為材料進行了組織培養，為百合種球的生產提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

選用生長健壯、無病蟲害的野百合鱗莖，本實驗所用百合采自貴州黔東南州鎮遠縣羊場鎮，2017年11月采集自然生境生長的野百合鱗莖，采集回來種植在實驗園地，隨時取用。取用百合鱗片作為本次試驗的外植體。

1.2 實驗器材與試劑

海爾冰箱（BCD-268TN）、光照恒溫培養箱（G2X250C）、全自動數顯立式高壓滅菌器（YXQ-LS-755Ⅱ）、超凈工作臺（JH-1S）、電磁爐（SK2002）、賽多利斯天平（BSA124S）、pH測定儀（TEW-Ⅲ）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 配制培養基

配制MS基本培養基母液，稱取NH4NO31600 mg、KNO31900 mg、CaCl2·2H2O 440 mg、MgSO4·7H2O 370 mg、KH2PO4170 mg、KI 0.83 mg、H3BO36.2 mg、MnSO4·H2O 16.9 mg、ZnSO4·7H2O 8.6 mg、Na2MoO4·2H2O 0.25 mg、CuSO4·5H2O 0.025 mg、CoCl2·6H2O 0.025 mg、Na2EDTA·2H2O 37.3 mg、FeSO4·7H2O 27.8 mg、甘氨酸 2.0 mg、鹽酸硫胺素0.4 mg、鹽酸吡哆醇 0.5 mg、煙酸 0.5 mg、肌醇100 mg、蔗糖30 g，加蒸餾水溶解，定容至1 L，pH調節至5.7。按照實際需求稀釋培養基母液。配制母液需要用剛制備的蒸餾水，以保證母液濃度的準確性，配好的母液需清澈透明才能使用。培養基經高壓滅菌后pH值一般要降低，所以在滅菌前調pH值時要相應調高0.1～0.2。

1.3.2 滅菌

將配制好的培養基趁熱分裝到培養瓶中（33 mL/瓶）。把燒杯（1000 mL、500 mL、250mL、100mL各1個）、培養皿（100mm一套）、濾紙、槍形鑷、解剖刀等實驗用品分別用報紙和橡皮筋包扎好，整齊規范地放入全自動數顯立式高壓滅菌器中，121℃、101kPa滅菌20 min。

1.3.3 準備實驗材料

將采集的百合鱗片用洗潔精輕輕清洗一遍，用大量自來水清洗數遍，直到水清澈明亮，瀝干水備用。

1.3.4 接種

用75%的酒精對超凈工作臺臺面進行消毒，打開紫外燈和通風開關，將接種所需要的材料和用具放入超凈工作臺滅菌。滅菌后開始接種，首先用75%的酒精噴灑雙手，把已洗凈瀝干水的百合鱗片放入燒杯中，用75%的酒精消毒15 s，無菌水沖洗5次，再用0.1%的次氯酸鈉溶液消毒8 min，無菌水沖洗5次，最后用0.1%升汞溶液消毒10min，無菌水沖洗5次，消毒時要讓消毒液將百合鱗片完全浸泡。消毒完后瀝干水放入墊有無菌濾紙的培養皿中，在點燃的酒精燈旁將百合鱗片切成1mm×1mm大小的外植體，用槍形鑷接種到培養瓶中，每瓶接種3個外植體。再次接種前需要將解剖刀和槍形鑷放在酒精燈外焰上灼燒，避免其所帶的細菌在接種過程中污染外植體，影響實驗結果。

1.3.5 培養

1.3.5.1 愈傷組織誘導培養

愈傷組織誘導培養基配方為MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，對NAA、6-BA設置了6個不同的濃度梯度（見表1），將鱗片外植體接種于該培養基中進行培養，重復3次。

1.3.5.2 不定芽分化培養

不定芽分化培養基配方為MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，對NAA、6-BA設置了6個不同的濃度梯度（見表1），選擇長勢良好、顏色黃、塊大的愈傷組織，切為正方形小塊，接種到配制好的分化培養基中進行不定芽分化培養。

1.3.5.3 生根培養

生根培養基配方為MS+NAA+6-BA+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，對NAA、6-BA設置了4個不同的濃度梯度（見表1），將長勢好、高1～3 cm的不定芽接種到生根培養基中誘導生根。

1.3.6 培養條件

把接種好外植體的培養瓶放入光照恒溫培養箱中培養，光照12h/d，光照強度2000lx，溫度25℃。

1.4 實驗數據統計與分析

誘導率=誘導個數/總個數；分化率=分化個數/總個數；用方差分析（One-way ANOVA）分別檢驗誘導率、分化率和生根率的總體差異性，用LSD法比較組間差異性。

表1 不同培養基外源激素用量（單位：mg/L）

2 結果與分析

2.1 愈傷組織誘導培養結果分析

誘導個體每組3個重復，每個重復90個誘導個體。愈傷組織萌發率在6組激素之間存在顯著的差異性（F=1248.60，df=5，p＜0.001，One-way ANOVA），萌發率由⑤、③、⑥、④、①、②依次顯著降低，如圖1所示。實驗結果表明，1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA為誘導鎮遠野百合愈傷組織的最佳激素組合，而激素1.5mg/L 6-BA+0.01mg/L NAA最不適合誘導鎮遠野百合生長愈傷組織。

圖1 愈傷組織誘導培養誘導率

2.2 不定芽分化培養結果分析

不定芽長勢在6組激素之間存在顯著的差異性（F=4850.06，df=5，p＜0.001），長勢④、（③=⑥）、⑤、②、①依次顯著下降，如圖2所示。實驗結果表明，激素組1.5mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA比較適合分化鎮遠野百合不定芽生長，而激素組1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA不適合分化鎮遠野百合不定芽生長。

2.3 生根培養結果分析

根長勢在4種培養基中之間存在顯著的差異性（F=279.74，df=3，p＜0.001），根長勢由③、②、④、①依次顯著變差，如圖3所示。實驗結果表明，激素組別1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA比較適合鎮遠野百合生根，激素組別1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA不適合鎮遠野百合生根。NAA的濃度不宜太高，太高不利于根的生長，綜合來看，NAA的濃度在1.0mg/L 比較合適。

圖2 不定芽分化培養分化率

圖3 生根培養生根率

3 結論

植物組織培養中的基本培養基有很多種，選擇正確的基本培養基是成功的起點。本實驗中選擇的MS基本培養基是植物組織培養中最常用的培養基。而植物組織培養中的外源激素種類也很多，選擇NAA、6-BA這兩種外源激素作為本次實驗的外源激素，是因為這兩種外源激素在植物組織培養中的應用較多，生長素在組織培養中的主要作用是誘導細胞的分裂和根的分化，誘導愈傷組織，細胞分類素主要促進細胞分裂和由愈傷組織上或器官上分化不定芽。生長素與細胞分裂素的比值是根和芽形成的控制條件，決定著發育的方向，是愈傷組織、長芽還是長根。通過實驗對比得知，在植物生長調節劑對鎮遠野百合組織培養的影響中，誘導鎮遠野百合愈傷組織生長的最佳培養基配方為MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA；最佳不定芽分化培養基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA；最佳生根培養基配方為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0mg/L NAA。其他的基礎培養基及其他的激素濃度配比也有適合的可能，這需要進一步實驗研究。