西紅花中苦藏花素的分離及抑菌研究

陳天翱，陳封政

（1.四川省樂山第一中學校，四川樂山 614000；2.樂山師范學院 化學學院，四川樂山 614000）

西紅花（Crocus sativus L.）為鳶尾科番紅花屬植物的干燥柱頭，主產于印度、伊朗、西班牙和意大利等[1]。西紅花于唐代時由印度經西藏傳入我國，故西紅花又稱為藏紅花、番紅花，目前西紅花在我國江浙一帶有大面積栽培。西紅花藥用歷史悠久，具有活血化瘀、解毒安神、涼血解毒等功效[2]，但西紅花產量極低，有報道稱10萬株西紅花才能產生1千克柱頭，故西紅花價格昂貴，有“植物黃金”之稱[3]。西紅花的主要活性成分和特征成分為西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ，《中華人民共和國藥典》（2015年版）以西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的總含量為指標成分。梔子是一種廉價的中藥材，該藥材中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量很高[4]，故一些不法商人就向西紅花提取物或含有西紅花的產品中人為摻雜梔子或從梔子中分離出的西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ來以次充好。為了從西紅花中尋找更特征的成分，對西紅花的成分進行了研究，分離得到了一純品化合物，經核磁鑒定該化合物為苦藏花素，并進行了抑菌活性測試。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西紅花，購自樂山市康發藥業有限公司（產地：西藏），產品批號1604407；左氧氟沙星，購自百靈威科技有限公司；菌種：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli），均由樂山師范學院微生物室提供；培養基：牛肉膏蛋白胨培養基。

干燥箱、培養箱、移液槍、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、真空抽提器、循環水真空泵、旋轉蒸發儀、GeLai制備液相色譜、Waters色譜儀、Varian INOVA 400核磁共振譜儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 苦藏花素的提取與純化

稱取100 g西紅花，用500 mL乙醇室溫浸泡提取6天，過濾；濾渣再次用500 mL乙醇室溫浸泡提取6天，過濾，合并濾液。在50 ℃條件下減壓濃縮濾液至膏狀，用水將膏狀物制成50 mL溶液，先用普通濾紙過濾，濾液再用0.45 μm的濾膜過濾，得到樣品的制備液。將該制備液一次性吸入制備液相色譜柱，以乙腈-水為流動相梯度洗脫：運行時間60 min。0 min時，乙腈含量為10%，60 min時，乙腈含量為70%；流速20 mL/min，檢測波長220 nm，按照峰收集洗脫液。經過多次制備分離，得到一純度較高組分，然后以分析液相色譜儀檢測該化合物純度。

1.2.2 苦藏花素的結構鑒定

以氘代甲醇為溶劑，用Varian INOVA 400核磁共振譜儀進行核磁測試，通過核磁共振氫譜和碳譜圖解析目標化合物的結構。

1.2.3 苦藏花素抑菌活性的測定

1.2.3.1 菌懸液的制備

根據參考文獻[5]，分別制備金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌濃度為107個/mL的試驗菌懸液，備用。

1.2.3.2 抑菌試驗

用移液槍精密吸取各種菌懸液0.2 mL放入培養基中，用無菌三角玻璃涂布棒將菌懸液涂抹均勻。將滅菌的濾紙圈（濾紙圈直徑為5 mm）在0.5 mg/mL的樣品中完全浸透，然后將濾紙圈覆蓋在培養基上，將培養皿置于生化培養箱中，37 ℃條件下培養24 h，用游標卡尺測定抑菌圈的直徑。陽性對照為左氧氟沙星（0.5 mg/mL）；陰性對照為無菌蒸餾水。每組實驗設3次重復，抑菌圈直徑取平均值。

2 結果與討論

2.1 苦藏花素的制備

從100 g西紅花中制備分離出一純度較高組分，濃縮后得到化合物25 mg，以分析液相色譜儀檢測該目標化合物純度為94%（檢測條件：檢測波長220 nm，流速1 mL/min，洗脫液：乙腈-水，設定時間為20 min，0 min時，乙腈比例為10%，20 min時，乙腈比例為60%），見圖1。從圖1可以看出，該目標化合物中仍含有少量雜質，這些雜質的出峰時間分別為5.42 min、7.98 min和13.44 min，從出峰時間可以看出，主要雜質（出峰時間分別為5.42 min和7.98 min）的極性比目標化合物強，次要雜質（出峰時間為13.44 min）的極性比目標化合物弱，三種主要雜質的總含量低于6%，單個雜質的含量約為目標化合物的2%，故做核磁測試時，雜質不會影響該目標化合物的鑒定。

圖1 苦藏花素的HPLC純度

2.2 苦藏花素的鑒定

通過核磁測試得到該化合物的核磁共振氫譜圖（圖2）和碳譜圖（圖3）。通過核磁共振譜可以看出，δH10.08（1H, s）和δC192.4為明顯的醛基信號；δH1.18（3H, s），1.16（3H, s） 與 δC29.1，27.8為碳上角甲基信號，且化學位移相近，性質相似；同樣δH2.10（3H, s）與δC19.2亦為碳上角甲基信號；δC154.3和δC139.5是一組雙鍵碳信號；δC101.3，77.2，77.2，73.9，70.5，69.7，61.5 是一個六碳糖的信息，其中δC101.3是糖上的端基碳。這些數據與文獻[6-7]報道的苦藏花素的核磁數據基本一致。故該化合物鑒定為苦藏花素（picrocrocin），其結構式如圖4，其氫譜和碳譜數據歸屬見表1。

圖2 苦藏花素的核磁共振氫譜

圖3 苦藏花素的核磁共振碳譜

表1 苦藏花素的NMR數據

圖4 苦藏花素的結構

2.3 苦藏花素抑菌活性試驗結果

以左氧氟沙星為陽性對照，以無菌蒸餾水為陰性對照，采用抑菌圈法測定化合物的抑菌活性。抑菌圈直徑越大表示化合物的抑菌活性越強。抑菌實驗測量數據見表2。

從表2可以看出，苦藏花素對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌均有抑制作用，尤其對枯草芽孢桿菌的抑制作用更強，但活性均弱于陽性對照左氧氟沙星。

表2 苦藏花素的抑菌圈直徑

3 結論

對西紅花成分進行成分分離，得到了純品，通過核磁共振技術鑒定為苦藏花素，并通過抑菌圈法研究了該化合物對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌的抑菌活性，結果顯示苦藏花素對三種菌都有抑菌作用，其中對枯草芽孢桿菌的抑菌活性略強。

西紅花臨床用途很多，用于治療心血管病、心臟病、肝病、癔癥、中風、癰腫等疾病。現代藥理報道西紅花的生理活性很多，如抗腫瘤、抗氧化和降血脂等[8]。通過對苦藏花素抑菌活性研究，顯示西紅花具有抑菌作用，該研究為擴大西紅花的使用范圍奠定了理論基礎。