慢性乙肝患者的乙肝病毒大蛋白檢測的臨床價值

王曙光 滕義建 王芳

（江蘇豐縣人民醫院檢驗科 江蘇 徐州 221700）

目前臨床對HBV感染患者,通常采用血清學指標如乙肝二對半、HBV-DNA和肝功能檢測,來監測HBV感染者的病情輕重、傳染性大小及評價抗病毒藥物療效等，但是由于e抗原敏感性較差，使得檢測結果很難真實反應患者乙肝病毒活躍程度，而HBV-DNA檢測又受一定條件限制，也很難大規模開展。近年隨著對HBV大蛋白(large sueface protein LP)在檢測HBV感染與復制及用于制備重組疫苗、藥物等方面的探究，使其作為新的和更有價值的、可靠的乙型肝炎抗病毒治療監測的血清免疫學指標之一，受到臨床廣泛關注，現各大醫院已常規開展檢測,我科目前也已開展該項檢測。

1.材料與方法

1.1 一般資料

收集2015年1月—2016年12月在我院就診者，共120例慢性乙肝病毒患者，診斷標準符合2005年中華醫學會肝病分會、中華醫學會傳染病分會聯合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》的慢性肝炎診斷標準。其中男68例、女42例，年齡19～77歲之間。所有選擇對象留取血清2ml，-80℃凍存備用。

1.2 主要儀器與試劑

檢測儀器包括美國伯樂的洗板機和酶標儀，廈門安普利熒光定量PCR儀，日立7600生化分析儀等。乙肝兩對半試劑由上海科華生物工程有限公司提供，廈門英科新創公司提供HBV-LP抗原與PreS1抗原檢測試劑，HBV-DNA定量檢測試劑由廈門安普利科技有限公司生產，肝功能檢測試劑購自上海科華生物工程有限公司。

1.3 檢測方法

乙肝兩對半檢測采用ELISA法，HBV-LP采用酶標定性檢查,Pre-S1抗原采用 ELIS雙抗體夾心法檢測。以上檢測均嚴格按照試劑盒操作說明書進行操作，選擇波長450nm通過酶標儀測定，讀取各孔OD值，并按說明書要求設Cut off值，測定結果大于Cut off值為陽性。采用熒光定量PCR法測定HBV-DNA，病毒載量單位以copies/ml表示，參考臨界值為5*102copies/ml。肝功能項目測定按照要求，用日立7600全自動生化分析儀檢測，校準品由試劑廠家提供，質控品為伯樂公司提供。

1.4 結果統計

結果的統計學方法采用SPSS18.0軟件進行處理，將所有有效數據輸入到Excel表中，計數資料采用卡方檢驗進行比較組間差異，計量資料采用方差分析進行比較組間差異， 將P＜0.05作為具有統計學意義的差異。

2.結果

2.1 120例慢性乙肝患者血清HBV-LP、HBV-DNA、Pre-S1和HBeAg陽性例數與陽性率見表1。

結果分析如下：HBV-LP與HBeAg陽性率之間的差異具有統計學意義(χ2=81.4，P＜0.05)；HBV-LP與HBV-DNA之間的結果差異不明顯(χ2=1.035，P=0.326)；HBV-LP與Pre-S1陽性率之間的差異具有統計學意義(χ2=35.3，P＜0.01)。

表1 慢性乙肝患者HBV.LP、HBV DNA、Pre—S1和HBeAg陽性例數與陽性率比較

2.2 75例HBeAg陽性血清和35例HBeAg陰性血清的HBVLP與HBV-DNA檢測結果比較見表2。

通過比較發現，HBeAg陽性患者的HBV-LP陽性率明顯高于HBeAg陰性患者，他們之間的差異具有統計學意義(χ2=19.2，P＜0.05)；HBeAg陽性患者的HBV-DNA陽性率則明顯高于HBeAg陰性患者的HBV-DNA結果，他們之間的差異亦具有統計學意義(χ2=30.2，P＜0.05)；另外，經統計學處理發現無論HBeAg陽性組或者HBeAg陰性組，HBV-LP與HBV DNA陽性率之間的差異均無統計學意義(χ2=1.29，P＞0.05)。

表2 HBeAg陽性和HBeAg陰性患者的HBV-LP與HBV-DNA檢測結果比較

2.3 HBV-LP各孔OD值結果與HBV-DNA拷貝數之間的相關性比較，見表3。

通過分析HBV-LP、Pre-S1各孔吸光度值（OD）值與HBVDNA拷貝數之間的關系，發現兩者呈正相關性。

表3 HBV-LP、Pre-S1A值與HBV-DNA拷貝數之間的結果比較

2.4 HBV-LP表達與肝功能各指標間的結果比較，見表4。

經統計，HBV-LP陽性患者谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶水平明顯高于HBV-LP陰性患者(P＜0.05），而總蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、總膽紅素（T-BIL）水平之間的差異無統計學意義。

表4 HBV-LP結果與肝功能各項指標的比較

3.討論

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種傳染性病毒，對人類健康危害很大，感染后發展成慢性乙肝以致肝硬化肝的比率很大，因此人們對其重視程度越來越高，對其調查與研究亦日益增多。據報道當前全球范圍內有4億人左右是慢性乙型肝炎病毒攜帶者，其中75%感染者分布在在亞洲和西太平洋地區。在中國，乙型肝炎是高發區，乙型肝炎病毒的攜帶率占總人口的10.3%左右 ，另外由于流動性人口的不斷增加，乙肝病毒攜帶者的人數亦不斷上升。這其中約有10%的乙肝患者轉化為慢性肝炎[1]。而慢性肝炎患者可以從無癥狀到隱性癥狀到漸漸變為嚴重的慢性肝損傷如肝硬化以及肝細胞癌。據報道25%一40%乙肝病毒感染者將發展為肝硬化和肝癌[2]，對患者健康威脅很大乙肝病毒大蛋白（HBV-LP）是病毒形成完整外膜的重要標志，其包含PreS1、PreS2和S三個結構域，與病毒復制密切相關[3]。因此，對乙肝病毒各個項目的檢測，及時采取治療措施具有十分重要的意義。

HBV作為傳染性疾病之一，在我國屬于危害比較重的一種疾病，目前臨床判斷乙型肝炎患者病毒是否存在復制的常用指標是Hear以及HBV-DNA，它們反映了人體對乙型肝炎病毒的免疫反映狀態以及所秉承的轉化過程，也是判斷患者傳染性及預后情況的傳統指標。但臨床發現，一部分HBeAg陰性患者依然存在乙肝病毒的大量復制，并且HBV-DNA檢測條件要求高，質量控制嚴格，有的醫院并不是每天都檢查，這使其檢測特別在基層醫院難以普及。

研究證明，乙肝病毒大蛋白在病毒復制過程中起著關鍵作用[4]，它是構建Dane顆粒包膜蛋白和管狀顆粒的重要成分。乙肝病毒大蛋白具有雙幣-拓撲學構像，面向內質網的管腔的Pre-S區可以介導成熟病毒顆粒與細胞吸附，而面向細胞質的Pre-S區在病毒組裝中發揮相關功能，同時大蛋白的Pre-S2區具有與蛋白激酶C相互作用啟動細胞間信號轉導的作用[5]。肝細胞內的乙肝病毒大蛋白積累過多可以導致內質網應急反應，可導致肝細胞損傷，這可能與HBV-LP促進CAPN2、eIF3K及PPP2CB表達促發細胞凋亡有關[6]。肝細胞損傷后釋放乙肝病毒顆粒到血液中去，使患者血清中檢測到HBV—LP成為可能。本報告研究發現HBV-LP與HBV-DNA有明顯相關性，提示HBV—LP的結果表達與病毒的復制有關，這為臨床判斷病毒復制與否提供新的實驗室指標。另外在慢性乙肝患者中，HBV-LP與HBV-DNA兩者之間檢出結果無明顯差異，但明顯高于Pre-S1和HBeAg陽性率。由此可知，HBV-LP相比Pre-S1能更加真實地反映出病毒的復制情況，其在臨床的應用有更大的價值。

通過對患者的肝功能分析發現，HBV-LP陽性患者的ALT、AST水平高于HBV-LP陰性患者，由于ALT和AST是反映肝細胞損傷極為靈敏的指標，提示HBV-LP的表達與肝細胞損傷有關。

通過進一步的分析發現，慢性乙肝患者的HBV-DNA拷貝數與HBV-LP平均OD值之間具有良好的相關性，說明HBV-LP在基層醫院不具備HBV-DNA檢測的情況下，可以作為替代檢測指標。

總之，HBV-LP檢測方法簡便易行，且與HBV-DNA檢測結果有良好的相關性，同時HBV-LP的表達與肝臟疾病的發生發展密切相關，這表明HBV—LP的檢測可稱為預測肝臟疾病發生發展的新指標，是慢性乙肝檢測指標的有益補充。乙肝兩對半與HBV—LP的聯合檢測對于臨床判斷病情 選擇最佳治療方案 檢測病情變化和觀察臨床療效具有重要的意義。