結(jié)直腸癌中GLUT-1、HIF-1α表達(dá)的臨床意義

武雪亮，王立坤，周海豐，郭 飛，楊永江，劉 博，楊東東，屈 明，薛 軍

據(jù)GLOBOCAN 2012統(tǒng)計(jì)中國人群結(jié)直腸癌目前排位死因順位從第7位上升到第5位，男女死亡率分別為9.0/10萬和6.1/10萬，嚴(yán)重威脅國民健康[1]。盡管近年來結(jié)直腸癌的普查力度不斷加強(qiáng)、手術(shù)方式不斷改進(jìn)、靶向藥物大力推廣，并取得了一系列的突破，但其5年生存率不足60%，仍是公共衛(wèi)生的關(guān)鍵問題[2]。因此，對(duì)結(jié)腸直腸癌的深入研究尤對(duì)其分子生物學(xué)研究具有很高的臨床價(jià)值。GLUT-1(glucose transporter,GLUT-1)是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中最重要的成員，廣泛存在于真核生物和原核生物中，在腫瘤早期生長，癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲等方面均具有重要作用。相關(guān)報(bào)道證實(shí)，在乳腺癌、食管癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)GLUT-1的高表達(dá)，GLUT-1的活性和表達(dá)水平與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[3-5]。目前，GLUT-1在結(jié)直腸癌方面的研究鮮有報(bào)道，該研究通過對(duì)結(jié)直腸癌和正常結(jié)直腸組織行免疫組織化學(xué)染色分析檢測(cè)，旨在探討GLUT-1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況及與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌靶向診療提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1病例資料收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科2016年9月～2017年1月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織50例和正常結(jié)直腸的組織50例，結(jié)直腸的癌組織自癌灶中心處取得，另外取經(jīng)病理證實(shí)為正常腸組織的標(biāo)本切緣。所有病例為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前沒有行針對(duì)性治療，如新輔助放化療等，術(shù)后標(biāo)本均在1 h內(nèi)獲得，并存于液氮中。

1.2主要試劑和實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1主要試劑 兔抗GLUT-1多克隆抗體、鼠抗人HIF-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)單克隆抗體購自美國Abeam公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購自上海Gene Tech公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色 10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80 ℃烤箱對(duì)切片進(jìn)行烘烤30 min，再用乙醇進(jìn)行脫水，并使內(nèi)源性過氧化物酶滅活，應(yīng)用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復(fù)過程；之后PBS洗3次，加入一抗(1 ∶100)50 μl，溫度控制于4 ℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μl。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化后流動(dòng)清水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明和樹膠行封片處理，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，光鏡下觀察。

1.2.3陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[6]GLUT-1陽性染色主要集中于細(xì)胞質(zhì)中，少量表達(dá)于細(xì)胞核，HIF-1α陽性染色主要集中于細(xì)胞核，少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，均為棕黃色或褐色顆粒，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比并評(píng)分，≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%時(shí)為2分，51%～75%時(shí)為3分，>75%時(shí)為4分；同理，無著色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深黃色為3分。然后兩組相乘，0分：-,1～4分：+,5～8分：,9～12分：，陽性包含+～。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示，GLUT-1和HIF-1α的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析，采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)設(shè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1結(jié)直腸癌、正常組織中GLUT-1和HIF-1α表達(dá)情況癌組和正常組織中GLUT-1陽性表達(dá)率分別為68.00%(34/50)、16.00%(8/50)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；癌組和正常組織中HIF-1α陽性表達(dá)率分別為72.00%(36/50)、20.00%(10/50)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見圖1、表1。

2.2GLUT-1和HIF-1α表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系GLUT-1和HIF-1α的表達(dá)都和腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤有關(guān)(P<0.05)。TNM分期高、分化程度越低、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的患者GLUT-1和HIF-1α的表達(dá)均增強(qiáng)，而GLUT-1和HIF-1α的陽性表達(dá)與患者腫瘤大小無相關(guān)性(P>0.05)，見表2。

2.3GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達(dá)的相互關(guān)系GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯相關(guān)(r=0.508，P<0.001)。GLUT-1在HIF-1α陽性組中的表達(dá)(陽性率80.56%)明顯高于在HIF-1α陰性組中的表達(dá)(陽性率35.71%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見表3。

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多個(gè)基因調(diào)控的多步驟、多因素、多階段的復(fù)雜過程，其中失控性生長和不斷侵襲增殖是惡性腫瘤細(xì)胞的最主要特征，這種特征的維系主要靠葡萄糖的無氧酵解為其提供能量，該過程即使在氧充足的環(huán)境下仍可持續(xù)進(jìn)行[7]。由于腫瘤的高消耗、高代謝，需要較普通細(xì)胞成倍的能量。而正常情況下，葡萄糖無法獨(dú)立通過細(xì)胞膜的雙分子層結(jié)構(gòu)，必須依賴跨膜分布的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為載體，因而這類載體的活性及表達(dá)量對(duì)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖具有極其重要的意義[8]。

GLUT-1是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最重要的成員，GLUT-1內(nèi)含492個(gè)氨基酸，由12個(gè)疏水性的跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域、兩個(gè)電荷的膜內(nèi)區(qū)及膜外區(qū)構(gòu)成[9]。Deng et al[10]解析的人源GLUT-1的晶體結(jié)構(gòu)顯示其經(jīng)典的協(xié)助轉(zhuǎn)運(yùn)超家族的折疊方式：12個(gè)跨膜螺旋組成NH2-端和-OOH端2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中的腔孔呈向胞內(nèi)區(qū)展開，這即是其轉(zhuǎn)運(yùn)的基礎(chǔ)框架。

腫瘤細(xì)胞膜上的GLUT-1的表達(dá)受多種途徑調(diào)節(jié)，目前研究較多的有磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑和HIF-1α和p53途徑，PI3K/AKT/mTOR與癌細(xì)胞的增殖、微血管形成和轉(zhuǎn)移蛋白的合成關(guān)系密切，且需要大量能量供應(yīng)，在肝癌、胃癌、子宮癌等腫瘤細(xì)胞中均證實(shí)能上調(diào)GLUT-1的表達(dá)[11]。

圖1 結(jié)直腸正常組織和癌組織中GLUT-1、HIF-1α蛋白的表達(dá) SP×200 A：GLUT-1；B：HIF-1α；1：正常組織；2：結(jié)直腸癌組織

組別nGLUT-1/HIF-1α (n)-+陽性率(%)χ2值P值結(jié)直腸癌5016/149/811/1214/1668.00/72.0016.386/14.438<0.001/<0.001正常5042/404/62/32/116.00/20.00

表2 GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及與臨床病理因素的關(guān)系[n(%)]

表3 GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性(n)

本研究顯示GLUT-1和HIF-1α在正常腸黏膜和腺癌中的表達(dá)水平逐步上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明在腸黏膜癌變的過程中，細(xì)胞膜上的GLUT-1和HIF-1α水平不斷上調(diào)，從而確保腫瘤對(duì)能量的攝取。進(jìn)一步研究顯示，GLUT-1和HIF-1α表達(dá)水平與結(jié)直腸癌的病理分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤均明顯相關(guān)，且二者存在明顯相關(guān)性。HIF-1α是調(diào)控癌細(xì)胞對(duì)低氧耐受的關(guān)鍵蛋白，研究[12]表明，在肝癌細(xì)胞內(nèi)，HIF-1α能直接激活GLUT-1等糖酵解相關(guān)因子活性，從而滿足肝癌細(xì)胞的能量攝取，增強(qiáng)其對(duì)低氧的耐受力。在胃腫瘤體外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，低氧條件下應(yīng)用HIF-1α抑制劑處理后，癌細(xì)胞內(nèi)活性氧比例更高，凋亡更顯著[13]。楊通印 等[14]對(duì)142結(jié)直腸癌組織標(biāo)本行免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GLUT-1和HIF-1α表達(dá)明顯高于正常腸黏膜，且二者存在協(xié)同作用，在低氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)上調(diào)能誘導(dǎo)GLUT-1高表達(dá)，加速癌細(xì)胞糖酵解，促進(jìn)癌細(xì)胞浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上，GLUT-1異常表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌的發(fā)生和進(jìn)展有重要作用，深入探究GLUT-1和HIF-1α的作用機(jī)制有望為結(jié)直腸癌精確治療提供重要的理論依據(jù)。