血清TNF-α及MGP水平與維持性血液透析患者心臟瓣膜鈣化的關(guān)系

王 珺，韓林子，張 森，王德光

維持性血液透析(maintenance hemodialysis，MHD)患者常出現(xiàn)骨以外的軟組織鈣化，包括血管鈣化和心臟瓣膜鈣化(cardiac valve calcification，CVC)。心臟瓣膜鈣化是新發(fā)心血管事件和心血管死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也是動(dòng)脈粥樣硬化、左心室肥厚、動(dòng)脈鈣化等心血管疾病發(fā)病率和死亡率的強(qiáng)烈預(yù)測(cè)因子[1]。

研究[2]表明，MHD患者體內(nèi)存在微炎癥狀態(tài)并可能參與血管鈣化的形成。腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，也是被證實(shí)的在體內(nèi)外可促進(jìn)血管鈣化的炎癥因子。但TNF-α與心臟瓣膜鈣化的關(guān)系尚無(wú)相關(guān)研究；基質(zhì)Gla蛋白(matrix Gla protein，MGP)是血管平滑肌細(xì)胞分泌合成的蛋白，具有抑制血管鈣化的作用，參與多種血管病理生理過(guò)程。該研究測(cè)定MHD患者血清中TNF-α和MGP水平，并探討其與心臟瓣膜鈣化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1病例資料病例組選自2016年7月～2016年10月在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科病房住院的MHD患者66例。入選標(biāo)準(zhǔn)：① 年齡≥18歲；② 充分透析，每周3次，每次至少4 h；③ 規(guī)律血液透析3個(gè)月或以上。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 急性期感染；② 存在先天性瓣膜畸形、風(fēng)濕性心臟瓣膜病或行人工瓣膜置換者；③ 合并嚴(yán)重心功能不全、嚴(yán)重肝病或惡性腫瘤者。MHD患者再根據(jù)有無(wú)心瓣膜鈣化分為鈣化組(30例)和非鈣化組(36例)。對(duì)照組選擇同期健康體檢人群31例，年齡、性別、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)均與病例組相匹配，無(wú)高血壓、糖尿病、結(jié)締組織病、慢性腎臟病等病史，體檢肝腎功能、尿常規(guī)均正常。人口統(tǒng)計(jì)學(xué)、臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)均通過(guò)醫(yī)院檢查記錄以及問(wèn)卷調(diào)查獲得。

1.2空腹靜脈血樣標(biāo)本的處理靜脈血標(biāo)本均清晨空腹采取，離心后收集血清分裝于1.5 ml的EP管中，-80 ℃冰箱凍存。使用前取出至4 ℃冰箱中溶解，待完全溶解后作為實(shí)驗(yàn)樣本。

1.3ELISA檢測(cè)血清TNF-α及MGP測(cè)定嚴(yán)格遵照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)執(zhí)行，在酶標(biāo)儀(Infinite F50)450 nm波長(zhǎng)分別檢測(cè)TNF-α及MGP的吸光度(optical density, OD)值。以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，建立擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式，將樣本的OD值代入方程式，計(jì)算出樣本的濃度。ELISA試劑盒購(gòu)自于武漢Bio-Swamp公司。

1.4診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)2009年改善全球腎臟病預(yù)后組織(KDIGO)建議，采用超聲心動(dòng)圖法(西門子ACUSON+S 2000)檢測(cè)心臟瓣膜鈣化[3]。鈣化標(biāo)準(zhǔn)：主動(dòng)脈瓣瓣膜、二尖瓣瓣膜可探及1個(gè)或多個(gè)點(diǎn)狀或團(tuán)狀回聲增強(qiáng)，直徑超過(guò)1 mm。

2 結(jié)果

2.1一般臨床資料病例組66例，年齡20～80(53.7±14.2)歲。原發(fā)病：慢性腎小球腎炎32例(48.48 %)，高血壓腎病9例(13.64 %)，糖尿病腎病7例(10.61 %)，多囊腎7例(10.61 %)，狼瘡性腎病3例(4.55 %)，其他8例(12.12 %)。對(duì)照組為31例，年齡、性別及BMI均匹配的健康人群。在病例組中，心瓣膜鈣化者占45.45 %，顯著高于健康人群，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)表1。而在MHD患者中，瓣膜鈣化組平均年齡、透析齡均顯著高于非瓣膜鈣化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而這兩組的其他實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)包括血紅蛋白、白蛋白、三酰甘油、總膽固醇、血鈣、血磷、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶、C反應(yīng)蛋白比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

2.2血清TNF-α及MGP水平比較病例組血清TNF-α水平顯著高于對(duì)照組，MGP水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。MHD患者心臟瓣膜鈣化組血清TNF-α水平高于非鈣化組(P=0.027)，MGP水平低于非鈣化組(P=0.001)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1、表2。

2.3MHD患者血清TNF-α及MGP水平與臨床指標(biāo)的相關(guān)性血清MGP水平與年齡(r=-0.224，P<0.05)、堿性磷酸酶(r=-0.269，P<0.05)、TNF-α呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.242，P<0.05)；而血清TNF-α水平與年齡、透析齡、血紅蛋白、三酰甘油、總膽固醇、血鈣、血磷、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表1 研究對(duì)象的人口學(xué)特征及重要指標(biāo)

表2 MHD患者心臟瓣膜鈣化組與非鈣化組的比較

表3 TNF-α及MGP與MHD患者臨床指標(biāo)的相關(guān)性

2.4MHD患者心臟瓣膜鈣化的多因素Logistic回歸分析以瓣膜鈣化有無(wú)為因變量，多因素Logistic回歸分析顯示，透析齡、血清TNF-α水平是CVC的危險(xiǎn)因素(P<0.05，P<0.01)，而MGP是CVC的保護(hù)因素(P<0.05)。校正年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、血紅蛋白、白蛋白、C反應(yīng)蛋白、三酰甘油、總膽固醇、鈣磷乘積、甲狀旁腺激素、堿性磷酸酶后，透析齡每增加1個(gè)月，CVC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高5.3 %；血清TNF-α每增加1 pg/ml，CVC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高9.9 %；血清MGP每增加1 ng/ml，CVC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)減少56.0 %。見(jiàn)表4。

3 討論

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是MHD患者常見(jiàn)的并發(fā)癥和首要死亡原因，而心臟瓣膜鈣化是預(yù)測(cè)MHD患者心血管疾病和全因死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[4]。研究[5-6]顯示，心臟瓣膜鈣化在MHD患者中的發(fā)生率為25.5%～58%，該研究顯示，MHD患者心臟瓣膜鈣化的發(fā)生率為45.45%，且遠(yuǎn)高于健康人群，與既往研究[5-6]結(jié)果基本一致。CVC可致斑塊破裂、心肌缺血或梗死，晚期可能出現(xiàn)心律失常甚至心力衰竭等嚴(yán)重后果。本研究同賈鳳玉 等[7]研究均顯示，心臟瓣膜鈣化的患者透析齡顯著大于非瓣膜鈣化患者。且透析齡越長(zhǎng)，CVC發(fā)生率越高。研究[8]顯示，MHD患者發(fā)生CVC與鈣磷代謝紊亂、高甲狀旁腺激素血癥、高C反應(yīng)蛋白密切相關(guān)，但該研究并未顯示明顯相關(guān)性。可能與該研究樣本量較小，且研究對(duì)象有一定特殊性(均為MHD住院患者、病情較重)有關(guān)。

隨著年齡增長(zhǎng)，骨礦含量逐漸減少，軟組織鈣化出現(xiàn)，故有學(xué)者認(rèn)為瓣膜鈣化與衰老相關(guān)，衰老過(guò)程伴有細(xì)胞內(nèi)鈣含量的增多，鈣從骨骼向軟組織轉(zhuǎn)移[9]。該研究顯示，心臟瓣膜鈣化的MHD患者年齡顯著高于非瓣膜鈣化患者，也進(jìn)一步驗(yàn)證瓣膜鈣化與衰老相關(guān)的觀點(diǎn)。

在全身或局部沒(méi)有急性感染跡象時(shí)，尿毒癥患者血清炎癥標(biāo)志物水平仍輕度升高，稱之為“微炎癥狀態(tài)”，其實(shí)質(zhì)是免疫炎癥，具有相對(duì)隱匿且持續(xù)的特點(diǎn)[10]。該研究結(jié)果表明MHD患者體內(nèi)呈微炎癥狀態(tài)。筆者認(rèn)為，在血液透析過(guò)程中，反復(fù)穿刺動(dòng)靜脈瘺管、透析液和透析膜的生物不相容性、透析液中內(nèi)毒素污染、透析用水不純、血管通路感染尤其是深靜脈置管的感染是引起MHD患者血清炎癥因子水平升高的主要原因。在該研究中，伴有CVC的患者血清TNF-α水平明顯升高，揭示TNF-α在瓣膜鈣化過(guò)程中起重要作用，具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。

表4 心臟瓣膜鈣化的多因素Logistic回歸分析

MGP是維生素K依賴性循環(huán)蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約10 000 bp。體內(nèi)MGP缺乏的小鼠出生后約2個(gè)月就出現(xiàn)了廣泛性的動(dòng)脈鈣化，最終導(dǎo)致血管破裂而死亡，揭示了MGP參與了動(dòng)脈鈣化的抑制過(guò)程，是體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)血管鈣化抑制因子[11]。其主要作用機(jī)制可能為：① MGP與羥磷灰石結(jié)合直接抑制羥磷灰石的增加以及鈣的沉積；② MGP可與BMP-2結(jié)合，使其功能喪失，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)向成骨樣細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換；③ MGP可能通過(guò)抑制VSMC的凋亡(使VSMC維持收縮表型)而直接抑制血管鈣化的發(fā)生和發(fā)展[12]。MGP主要分布在軟骨、骨髓和動(dòng)脈壁，在心臟也呈高水平表達(dá)。該研究說(shuō)明了MGP的表達(dá)上調(diào)限制了瓣膜鈣化的發(fā)生。Venardos et al[13]發(fā)現(xiàn)，分別從鈣化和非鈣化的瓣膜中分離出瓣膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，鈣化的瓣膜間質(zhì)細(xì)胞MGP表達(dá)水平明顯減少。這些證據(jù)均表明，MGP是心臟瓣膜鈣化的抑制因子，其具體發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

隨著年齡增大，MGP表達(dá)下降甚至失活，機(jī)體失去鈣化防御機(jī)制，開(kāi)始出現(xiàn)異位鈣化。堿性磷酸酶是一組同工酶，骨特異性堿性磷酸酶可表達(dá)于成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或有鈣化傾向的細(xì)胞如鈣化的VSMC，在組織鈣化的發(fā)展中起重要作用。高血清堿性磷酸酶被認(rèn)為是MHD患者冠狀動(dòng)脈鈣化的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[14]，但該研究并未顯示堿性磷酸酶在CVC組有顯著升高，可能是其他種類堿性磷酸酶代償?shù)慕Y(jié)果。

多因素Logistic回歸分析顯示， MHD患者的透析齡及血清TNF-α均為心臟瓣膜鈣化發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，校正其他相關(guān)因素后，透析齡每增加1個(gè)月，心臟瓣膜鈣化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高5.3 %；血清TNF-α每增加1 pg/ml，心臟瓣膜鈣化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高9.9%，而血清MGP每增加1 ng/ml，心臟瓣膜鈣化發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)減少56.0 %，說(shuō)明MGP是心臟瓣膜鈣化的保護(hù)性因素。