Pkhd1基因缺陷對雄性小鼠生育能力的影響

毛 軍，徐雨辰，高晶晶，彭黨委，竇賢明，黃振宇，程 鵬，沈旭峰，張賢生

常染色體隱性多囊腎(autosomal recessive polycystic kidney disease， ARPKD)是嬰兒和兒童時期最常見的囊性腎病，其發(fā)生率約為1/20 000；在人群中，其隱性致病基因-纖囊蛋白基因(polycystic kid-ney and hepatic disease 1， Pkhd1)攜帶率估計為1/70[1]。遺傳連鎖研究[2]表明，致病基因突變位于人類染色體區(qū)域6p21.1-6p12。由Pkhd1基因編碼的FPC是一種包含4 074個氨基酸的完整膜蛋白。ARPKD患者的臨床表現(xiàn)差異很大，其典型的表現(xiàn)為先天性肝纖維化和多囊性腎病。因此，至今對于ARPKD的研究主要集中在腎臟和肝臟。而常染色體顯性多囊腎(autosomal recessive polycystic kidney disease， ADPKD)的男性生育力已有長期大量的相關(guān)研究[3]，且男性ADPKD患者的生育方面有相關(guān)缺陷。但相較于ADPKD,ARPKD的發(fā)病率低和死亡率高，鮮有研究男性ARPKD患者的生育相關(guān)問題。然而，Dell[4]發(fā)現(xiàn)ARPKD可以在從嬰兒期到成年期的任何年齡發(fā)病。而且，隨著現(xiàn)代肝腎移植手術(shù)進(jìn)步和呼吸系統(tǒng)并發(fā)癥護(hù)理水平提高，其存活率已經(jīng)得到了極大的改善。相關(guān)數(shù)據(jù)[5]顯示，接受腎移植的ARPKD患者的生存率可達(dá)到78%～92%。因此，ARPKD不再局限于兒科疾病，成人患者也可有相對溫和的臨床表現(xiàn)。隨著此類患者逐漸達(dá)到生育年齡，生育問題將不可避免。所以對于男性ARPKD患者，其生殖相關(guān)問題尤為迫切。研究[6]表明PKHD1基因及其產(chǎn)物與小鼠同源且功能相似。該研究主要通過觀察APPKD模型小鼠的生殖功能，探究Pkhd1基因?qū)π坌陨芰Φ挠绊憽?/p>

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性Pkhd1基因敲除小鼠(C57BL/6)10只，此小鼠模型(Pkhd1基因是否已敲除及其敲除程度)在本團(tuán)隊之前的研究已作詳細(xì)描述[7]。野生型小鼠各10只及若干只雌鼠，雄性鼠齡2～3個月，雌鼠鼠齡2～4個月，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院實驗動物中心提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境嚴(yán)格保證，晝夜明暗交替時間12/12 h，溫度20～24 ℃，相對濕度40%～70%，自由進(jìn)食水。實驗結(jié)束后，頸椎脫臼處死雄性小鼠并稱重，分離每只小鼠的睪丸和附睪并稱重，并計算相對體重。

1.2組織蘇木精伊紅染色(HE) 標(biāo)本經(jīng)10%中性甲醛充分固定后，經(jīng)梯度酒精脫水和二甲苯透明后，制作成蠟塊。4 μm連續(xù)切片，切片做HE染色。

1.3精子分離及其相關(guān)參數(shù)檢測

1.3.1精子分離 頸離斷處死小鼠后，分離一側(cè)附睪尾置于1.5 ml EP管內(nèi)并剪碎，滴加已預(yù)熱37 ℃的HTF液1 ml，微微震蕩后放入CO2培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)15 min，取上清液用于精子參數(shù)檢測。以下操作均重復(fù)計數(shù)200個精子，且嚴(yán)格按照《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊(第5版)》施行。

1.3.2精子濃度檢測 在200×倍數(shù)顯微鏡下，用改良Neubauer血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)精子數(shù)量并計算精子濃度。

1.3.3精子活力檢測 在200×倍數(shù)顯微鏡下觀察已制備好的濕片，按照精子的活力大小，將每個所觀察到的精子活力分為向前運動(PR)(精子主動地呈直線或沿一大圓周運動，不管其運動速度如何)、非向前運動(NP)(所有其他非向前運動的形式，如以小圓周泳動，尾部動力幾乎不能驅(qū)使頭部移動，或者只能觀察到尾部擺動)和不活動(IM)(沒有運動)三類，并統(tǒng)計分析。

1.3.4精子存活率檢測 將精子用苯胺黑伊紅染色(試劑購自印度 solarbio公司)，在400×倍數(shù)顯微鏡下計數(shù)評定精子死活。頭部白色被認(rèn)定為活精子，頭部紅色被認(rèn)定為死精子，并統(tǒng)計分析。

1.3.5精子形態(tài)學(xué)檢測 精子經(jīng)巴氏染色(試劑購自印度 solarbio 公司)，依用亮視野在1 000×油鏡下觀察涂片，記錄精子形態(tài)。

1.4生育力檢查參照Mao et al[8]的方法，生育力實驗采用雌雄合籠的方式。Pkhd1-/-和野生型雄鼠各5只，按照雌雄比2 ∶1，每個籠里放3只小鼠。每天檢查雌鼠是否“見栓”，將“見栓”雌鼠替換并單獨飼養(yǎng)至生產(chǎn)。每周替換未“見栓”的雌鼠。統(tǒng)計所有的“見栓”雌鼠、未“見栓”雌鼠、對應(yīng)生產(chǎn)窩數(shù)、總子代數(shù)，用于計算交配率(frequency of mating，F(xiàn)M)、懷孕率(rate of pregnancy，RP)及平均產(chǎn)仔率(average number of pups，ANP)。t檢驗和χ2檢驗被用于計算兩組的差異性。

2 結(jié)果

2.1Pkhd1-/-和野生型小鼠之間的肝臟、腎臟和生殖系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)在3月齡的小鼠中，Pkhd1-/-和野生型的腎臟之間沒有明顯的差異，見圖1A、1B；然而，相較于正常小鼠，3月齡的Pkhd1-/-小鼠的肝臟布滿囊腫。見圖1C、1D。其囊腫數(shù)量雖多，但因體積小而未壓迫正常肝組織，此時肝功能基本無影響。另外，睪丸體重比(P=0.138)和附睪體重比(P=0.179)在Pkhd1-/-和野生型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1E、1F)。而且，兩組雄性小鼠的生殖系統(tǒng)(睪丸、附睪、輸精管和精囊)的生物形態(tài)基本相似(圖1G～N)。在大體形態(tài)上，Pkhd1基因似乎對雄性小鼠生殖系統(tǒng)未產(chǎn)生影響。

2.2精子數(shù)目、活動力和存活率分析對小鼠附睪尾的精子數(shù)目的分析顯示，相較于野生型小鼠，Pkhd1-/-的精子總數(shù)顯著降低(P=0.029)。見圖2A。兩組精子活動力的差異性主要體現(xiàn)在向前運動類型精子(PR)方面，而野生型的非向前運動精子(NP)比例略低于Pkhd1-/-小鼠。但是，Pkhd1-/-的總精子活動力(PR+NR)明顯低于野生型組小鼠(P=0.013)。見圖2B。通過苯胺黑伊紅染色(圖2C)顯示，Pkhd1-/-和野生型小鼠的精子存活率分別為(76.40±8.289)%和(70.30±9.452)%，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.118)，見圖2D。且都在正常范圍(>58%)。

2.3精子形態(tài)學(xué)分析經(jīng)巴氏染色后觀察顯示野生型和Pkhd1-/-小鼠的精子畸形率分別為11%和17%，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(T:P=0.015; C:P=0.012)。Pkhd1-/-精子畸形率較高主要體現(xiàn)在其尾部卷曲比率較野生型小鼠精子高。 Pkhd1-/-精子的尾部更加容易發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)滴(CDs)(P=0.018)。見圖3。

2.4Pkhd1基因缺陷影響雄性小鼠的生育力表1顯示兩組小鼠的交配頻率(P=0.501)和受孕后小鼠的平均產(chǎn)仔率(P=0.255)差異無統(tǒng)計學(xué)意義；Pkhd1-/-組交配后雌鼠的受孕率(FP)明顯低于野生型組(P=0.028)，說明Pkhd1基因缺失可使雄性小鼠的生育力降低。

表1 Pkhd1基因缺陷可導(dǎo)致雄性生育力下降

圖1 WT和Pkhd1-/-小鼠的腎臟、肝臟和生殖系統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析

A：WT腎臟組織切片；B：Pkhd1-/-腎臟組織切片；C：WT肝臟組織切片；D：Pkhd1-/-肝臟組織切片；E：睪丸相對體重比；F：附睪相對體重比；G：WT睪丸；I：WT附睪；K：WT輸精管；M：WT精囊；H：Pkhd1-/-睪丸；J：Pkhd1-/-附睪；L：Pkhd1-/-輸精管；N：Pkhd1-/-精囊；A～D：×30；G～N：×100

圖2 Pkhd1基因缺失對精子濃度、活力和活率的影響 ×630

A：小鼠的精子數(shù)量；B：精子活力；C：Pkhd1-/-小鼠精子苯胺黑伊紅染色，“↑”：活精子；“∧”：死精子；D：精子活率；與WT比較：*P<0.05

圖3 Pkhd1-/-小鼠精子的形態(tài)特征

A、C：Pkhd1-/-小鼠精子巴氏染色×1 000；B：畸形精子比率；D：精子尾部伴CDs比率；T：總精子；C：尾部卷曲精子；“↑”：卷尾；“∧”：CDs；與WT比較：*P<0.05

3 討論

隨著越來越多的ARPKD患者達(dá)到生育年齡，其部分可能面臨生育問題。另一方面，大量研究[3]表明男性ADPKD患者存在生育缺陷，文獻(xiàn)中鮮有關(guān)于ARPKD患者生育力方面研究。本研究系統(tǒng)地對比研究了Pkhd1-/-和野生型小鼠生殖系統(tǒng)的大體形態(tài)、相對質(zhì)量及組織學(xué)檢查，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)異常。但是，Pkhd1基因選擇性拼接模式復(fù)雜，并產(chǎn)生多種不同功能蛋白，且Ward et al[9]通過免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)FPC(PKHD1基因產(chǎn)物)在胚胎的睪丸和附睪中表達(dá)。這就進(jìn)一步促使思考Pkhd1基因是否會對小鼠的生育能力產(chǎn)生影響。

基于以上研究結(jié)果及假設(shè)，對小鼠附睪尾精子進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示Pkhd1-/-小鼠附睪尾精子濃度和活動力顯著降低，精子的活率沒有顯著差距。見圖3。精子的活力決定于其正常形態(tài)，尾部畸形的精子一般無活性或者運動障礙且無法使卵子受精。因此，對Pkhd1-/-和野生型兩組小鼠進(jìn)行了附睪尾精子的形態(tài)學(xué)檢查。結(jié)果顯示Pkhd1-/-小鼠精子尾部有更多的胞質(zhì)滴(CDs)，且其尾部趨于卷曲。見圖4。在小鼠精子形成過程中，CDs來源于精子細(xì)胞的胞質(zhì)中，主要附著在精子尾部的中間部分。Xu et al[10]研究發(fā)現(xiàn)CDs的異?？赡軐影l(fā)生和精子活力產(chǎn)生影響。之前有研究[11]表明CDs被認(rèn)為與滲透壓的調(diào)節(jié)有關(guān)，因為當(dāng)精子在低滲透性的情況下，附睪精子的鞭毛很容易盤繞在CDs的位置上，這可能是由CDs上附著的幾個水通道蛋白的缺陷而導(dǎo)致的結(jié)果。在ARPKD中，盡管其囊腫形成、生長和擴(kuò)張的病理生理學(xué)仍不清楚，但是有研究[12]表明，ARPKD患者的水通道AQP1的表達(dá)和功能異常，且與ARPKD患者的囊腫擴(kuò)張有關(guān)。這提示在ARPKD小鼠中，異常的水通道可能是造成異常CDs的原因，而且CDs異常可以導(dǎo)致ARPKD小鼠精子尾畸形率上升，這些因素均可降低Pkhd1-/-小鼠的精子活力。

精子鞭毛結(jié)構(gòu)和生物起源很復(fù)雜，最近的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示了超過700種蛋白質(zhì)與其相關(guān)。在小鼠的精子發(fā)生過程中，基因異常會導(dǎo)致不同的表型，包括精子尾部的卷曲。尾部鞭毛的基因絲由中心體變形組裝而成，是精子尾部的重要組成部分。Zhang et al[13]研究報告顯示FPC定位于細(xì)胞中心粒，并參與中心粒的復(fù)制，且破壞FPC可影響中心粒功能并導(dǎo)致細(xì)胞分裂缺陷。因此，Pkhd1基因缺陷可能影響原始生殖細(xì)胞的有絲分裂和精原細(xì)胞的減數(shù)分裂，導(dǎo)致小鼠精子濃度下降；Pkhd1基因的破壞也可能會影響鞭毛的基因絲結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致精子尾動力系統(tǒng)的功能紊亂，最終致使雄性小鼠精子活力下降。

需要注意的是，小鼠生育能力過強，所以并不是一個完美的反映人類生育力的動物模型。人類更容易受到不健康的生活方式和致病因素的影響，包括吸煙、環(huán)境污染、生殖道感染和遺傳疾病等。有報道[14]表明諸如活性氧和輻射等累積性破壞在男性不育方面起著關(guān)鍵作用。此外，ARPKD小鼠模型與人類ARPKD嚴(yán)重癥狀相比，其臨床表現(xiàn)有一些不同：多數(shù)Pkhd1-/-小鼠可以擺脫胚胎致死而存活到成年，并表現(xiàn)出較輕的臨床癥狀[7]。本研究中，小鼠的生育力實驗結(jié)果表明Pkhd1-/-小鼠的生育能力明顯低于野生型小鼠。因此，推測Pkhd1基因缺失不僅會降低男性生育能力，更可能會造成部分患者不育。對于此類人群，必須指出的是，在青春期罹患終末期腎病的患者，即使通過腎移植手術(shù)治愈，但其精子發(fā)生并不能恢復(fù)，可能是因為青春期對睪丸發(fā)育及精子發(fā)生至關(guān)重要[15]。因此，在青少年ARPKD患者發(fā)展為尿毒癥之前，可以采取一些預(yù)防措施，如精液凍存等。

綜上，Pkhd1基因缺失可以使小鼠精子異常和相關(guān)參數(shù)下降，包括精子濃度減少、活力減弱、精子尾畸形率升高和CDs殘留比例提高。生育力實驗進(jìn)一步驗證了Pkhd1-/-小鼠生育能力明顯降低。Pkhd1基因?qū)е履行陨ο陆档淖饔脵C(jī)制仍需進(jìn)一步研究。且患有ARPKD的青少年可能面臨生殖問題的風(fēng)險，需要更多這方面的關(guān)注。