sFasL及其受體在雙陰性T細胞殺傷胰腺癌細胞中的作用及意義

胡丕波，陳 炯，鄔高華，周海波，趙金錢，楊旭東

近年來雖然醫療水平在不斷的進步，癌癥的治療效果逐年提高，但是胰腺癌卻是其中的一個例外，其起病隱匿，病情發現較晚，且極易發生轉移，常規方法治療預后不佳，5年生存率一直低于5%[1-2]。國際上熱門的“免疫療法”成為癌癥目前治療手段中最有前景的方法之一。“過繼免疫”的提出更讓人們看到了治愈腫瘤的曙光。其中雙陰性T細胞(double negative T cell，DNT cell)由于其明顯的抗腫瘤作用引起了眾多研究者的關注。楊仁保 等[3]在利用裸鼠模型進行的體內實驗中顯示DNT細胞可以殺傷胰腺癌細胞，但是其具體的殺傷機制尚無定論。Chang et al[4]研究報道了可溶性的FasL與其受體Fas結合介導肺癌細胞的凋亡，這為課題組提供了新的思路。該研究的目的是探索sFasL/Fas是否參與了DNT細胞殺傷胰腺癌細胞。

1 材料與方法

1.1病例資料人胰腺癌細胞株Panc-1、BXPC-3、Capan-1(中科院上海細胞庫)。人胰腺癌組織蠟塊標本和癌旁組織蠟塊標本各60例(距離癌組織>1 cm)。均取自2014年3月～2017年8月安徽醫科大學附屬省立醫院膽胰外科行切除術且病理證實為胰腺癌的組織。其中男34例，女26例；年齡(60.15±12.32)歲。所選患者術前均未進行過放療、化療等抗腫瘤治療。同時收集這60例胰腺癌患者的臨床病理資料。分離DNT細胞的人外周血標本取自未服用藥物、無免疫性疾病的健康人群。腫瘤分期參照美國癌癥委員會TNM分期手冊第7版。

1.2主要試劑胎牛血清(杭州四季青公司)；RPMI1640培養基、DMEM培養基(美國Hyclone公司)；FasL ELISA試劑盒(美國R&D Systems 公司)；CD4 +、CD8 + 去除液(加拿大Stemcell Technologies 公司)；白介素2(interleukin-2, IL-2)、白介素4(IL-4)、抗人T 淋巴細胞表面CD3 (OKT3)抗體(美國eBioscience 公司)；人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋公司)；兔抗人Fas抗體(英國Abcam公司)；蛋白提取試劑盒(南京Keygen 公司)；實時定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；逆轉錄試劑盒(美國Thermo公司)；TRIzol(美國Invitrogen 公司)。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養 DNT細胞的培養采用OKT3抗體吸附法。將CD4、CD8去除液(50 μl/ml)加入肝素鈉抗凝的10 ml健康人外周血中，靜置孵育20 min后，緩慢加入到含有等量淋巴細胞分離液的離心管中，保持液面分層然后離心，吸取中間云霧層細胞兩次洗滌，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基重懸細胞，然后接種到OKT3包被的培養瓶中，在37 ℃、5%CO2恒溫條件下靜置培養,每隔3 d滴加IL-2(1 μl/ml)和IL-4(1 μl/ml)促進生長。2～3 d換液，6 d移至較大的培養瓶中,12～13 d使用細胞。胰腺癌細胞培養：3株胰腺癌細胞均使用含10%胎牛血清的DMEM培養基靜置于37 ℃、5%CO2條件下恒溫培養，2～3 d換液傳代。

1.3.2Fas mRNA 檢測 采用qRT-PCR法，首先按照TRIzol試劑盒說明書提取3株胰腺癌細胞的RNA，根據逆轉錄試劑盒說明書操作合成cDNA。使用qPCR試劑盒進行擴增反應，反應體系為10 μl。Fas上游引物：5′- TTGCTTAGGGTTCCCTCCTG-3′，下游引物：5′-AAACTGGAGAGCAGACAGCA-3′。β-actin上游引物：5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG -3′，下游引物：5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG -3′。qPCR循環參數：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt計算mRNA表達量，實驗重復3次。

1.3.3Fas蛋白檢測 采用Western blot法，收取3株胰腺癌細胞并加入RIPA細胞裂解液提取蛋白，按照1 ∶4加入5×上樣緩沖液。沸水浴加熱10 min冷卻后上樣，SDS-PAGE電泳分離蛋白質，半干轉法將蛋白質轉移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉；滴加Fas一抗，4 ℃過夜；加入適當稀釋度的辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，室溫孵育2 h，然后PBST洗滌3次；加入ECL曝光液，曝光顯影后，使用Image J軟件進行條帶分析。

1.3.4sFasL檢測 采用ELISA法,將DNT細胞(5×106/ml)的培養液(換液過夜)作為實驗組，將未培養DNT細胞的培養液(換液過夜)作為對照組，各取100 μl進行檢測，按照ELISA試劑盒進行操作，讀取OD值，計算兩組sFasL的濃度。

1.3.5人胰腺癌組織Fas蛋白檢測 采用免疫組化法，取胰腺癌石蠟切片脫蠟后檸檬酸鹽高壓修復，緩慢冷卻至室溫，然后使用內源性過氧化物酶阻斷劑消除內源性過氧化物酶活性(30 min)，PBS沖洗3次，再滴加一抗Fas(1 ∶200)，4 ℃過夜，次日室溫下放置30 min，PBS沖洗3次，隨后滴加二抗孵育30 min，PBS沖洗3次，加入適量DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，烘箱烘干，最后中性樹脂封片。

1.4統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，兩組均數比較采用t檢驗，3組均數比較采用方差分析，定性資料采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1DNT細胞鏡下形態DNT細胞從健康人外周血中分離提取，最初細胞數量較少(1×105/ml)，呈現懸浮生長狀態，經過IL-2和IL-4的促進生長作用，細胞數量緩慢增加，13 d左右的可達到飽和狀態(細胞數量為5×106/ml)，見圖1。

圖1 DNT細胞形態 ×200

2.2FasmRNA在3種胰腺癌細胞中的表達差異PCR結果顯示mRNA在3種胰腺癌細胞中表達均有表達，3組之間的差異有統計學意義(F=211.56，P<0.05)，相互比較結果顯示Capan-1表達量低于BXPC-3(P<0.05)，Panc-1表達量高于BXPC-3(P<0.05)，見圖2。

圖2 3種胰腺癌細胞中Fas mRNA的表達情況

1: Capan-1; 2: BXPC-3; 3: Panc-1; 與BXPC-3細胞比較：*P<0.05

2.3Fas蛋白在3種胰腺癌細胞中的表達差異Western blot結果顯示Fas蛋白在3種細胞中均有較高表達，由低到高順序為Capan-1、BXPC-3、Panc-1。見圖3、4。

圖3 3種胰腺癌細胞中Fas蛋白的表達情況

圖4 3種胰腺癌細胞中Fas蛋白的表達量1:Capan-1; 2: BXPC-3; 3:Panc-1

2.4sFasL在DNT細胞培養液中的含量ELISA法檢測了20例健康人外周血來源分離培養的DNT細胞(5×106/ml)上清液以及未培養DNT細胞的上清液，結果顯示培養DNT細胞組上清液中sFasL含量為(64.52±2.21)pg/ml，對照組上清液中含量為(55.68±1.95)pg/ml，差異有統計學意義(t=3.00，P<0.01)。見圖5。

圖5 DNT細胞上清液和對照組中sFasL的含量與對照組比較：**P<0.01

2.5Fas在胰腺癌和癌周組織中的表達免疫組化結果顯示Fas蛋白主要的表達部位是在細胞質，胰腺癌組織的陽性表達率為42%(25/60)，在癌周組織的陽性表達率為68%(41/60)，差異有統計學意義(χ2=8.62，P<0.05)。見圖6。

圖6 Fas蛋白在胰腺癌和癌周組織中的表達情況 ×200

A：Fas在胰腺癌組織中的陰性表達；B：Fas在胰腺癌周組織中的陽性表達

2.6Fas的表達與臨床資料的相關性Fas在胰腺癌組織中的表達與腫瘤的分化程度、神經浸潤有關(χ2=5.659、6.251，P<0.05)，而與患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤分期、有無淋巴結轉移等無關。見表1。

表1胰腺癌組織中Fas蛋白的表達與臨床病理關系(n)

臨床病理特征nFas陽性例數Fas陰性例數χ2值P值性別 男3416180.9390.333 女26917年齡(歲) ≤602710170.4330.511 >60331518腫瘤位置 胰頭3116152.6110.106 胰尾29920分化程度 高231495.6590.017 中低371126TNM分期 Ⅰ～Ⅱ3818201.3860.239 Ⅲ～Ⅳ22715神經浸潤 有339246.2510.012 無271611淋巴結轉移 有3819192.9610.085 無22616

3 討論

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤，雖然現代外科技術的發展使胰十二指腸切除術圍手術期死亡率降至5%以下，但是30年來胰腺癌的長期存活率并未發生顯著改變。DNT細胞在各項疾病中均起到了關鍵的治療作用，特別是其抗腫瘤作用已成為人們關注的點。Lee et al[5]研究發現DNT細胞可以抑制急性白血病細胞的生長。Xu et al[6]通過實驗證明了DNT細胞通過NK細胞活化性受體(NKG2D) 及其配體主要組織相容性復合體I類相關基因A(MICA)途徑殺傷胰腺癌細胞。最近有研究[4]報道sFasL/Fas可以介導殺傷肺癌細胞。而本研究在DNT細胞上清液中檢測出了sFasL的表達，同時在胰腺癌細胞中檢測出其受體Fas的高表達，所以筆者有理由推測DNT細胞可以通過分泌sFasL與胰腺癌細胞表面的Fas結合介導殺傷胰腺癌細胞。

Fas是屬于TNF受體超家族成員的I型跨膜蛋白，與腫瘤壞死因子(TNF)受體具有一定的同源性。Fas的基因位于10號染色體，其基因分子長度為25 kb，共編碼了325個氨基酸。Fas蛋白可分為膜表達型(mFas)和可溶型(sFas)兩種形式。mFas分為3個部分：胞外部分、跨膜部分、胞內部分，其中胞內含有死亡結構域，可傳遞細胞凋亡信號。FasL屬于TNF配體超家族，是一種分子量40 ku的Ⅱ型跨膜蛋白，其基因位于1號染色體，共編碼281個氨基酸，其蛋白分子同樣也分為膜型(mFasL)和可溶型(sFasL)。Fas與FasL在體內是天然的受體與配體關系。Fas與FasL結合后，凋亡信號開始傳遞，受體分子中的死亡結構域構像改變，然后通過與死亡結構域相關蛋白(Fas-associated death domain, FADD)的C末端結合傳遞信號，信號在FADD中又通過N末端與caspase8結合，開啟半胱氨酸蛋白酶(caspase)分子的級聯反應，使得細胞凋亡[7-9]。Fas與FasL的結合，是細胞凋亡的關鍵步驟，所以癌細胞表面Fas受體的表達量對研究FasL是否參與細胞凋亡具有重要意義。

表達Fas的靶細胞與FasL結合后，靶細胞就會被誘導進入死亡程序，維持著人體細胞凋亡與增殖的平衡[10]。本研究在胰腺癌細胞和組織中均檢測了Fas的表達情況，其結果為：Fas mRNA在3株胰腺癌細胞中均有表達且存在一定差異，Fas蛋白在胰腺癌細胞中均有較高表達且表達差異與RNA的表達差異一致。而在免疫組化法檢測胰腺癌組織和癌周組織的結果中顯示：Fas蛋白在胰腺癌組織中表達較癌周組織表達較低，且低分化組織中的表達量明顯低于高分化組織。從中可以表明，Fas在胰腺癌組織中的表達下調，與其配體FasL的結合減少，導致胰腺癌細胞凋亡減少，發生免疫逃逸，細胞凋亡與增殖的動態平衡被打破，使得胰腺癌快速的發生發展得以進行。