氯硝柳胺磷酸酯通過抑制Wnt/β-catenin通路抑制腎臟組織纖維化

常曉燕, 吳啟美， 江 肖，吳永貴

現階段慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)已經成為全球性公共健康問題，其患病率和病死率極高，其中很大一部分患者可進展至終末期腎臟病(end stage renal disease，ESRD)。腎臟纖維化是各種慢性腎臟病進展至ESRD的共同途徑；腎臟纖維化是一個動態進展過程，包括啟動、活化、持續、進展等，在此過程中涉及多種信號通路及細胞因子的活化，其中Wnt/β-Catenin信號通路是被證實參與腎臟組織纖維化的重要信號通路[1]。

該研究所涉及到的一種藥物氯硝柳胺，商品名：滅絳靈、蕩絳靈、硝硫苯酯、育米生等，為美國 FDA已批準用藥，既往主要用于腸道寄生蟲感染，哺乳動物低毒性。氯硝柳胺難溶于水，腸道中很難吸收，前期的研究[2-3]在其原有的側鏈上加一磷酸基團，即氯硝柳胺磷酸酯(phosphate niclosamide，P-NICLO)，該衍生物可明顯增加藥物水溶性而不明顯影響其化學效應，大大擴展了其研究應用范圍[2-3]。該文中所提及的用藥均為氯硝柳胺的水溶性衍生物即P-NICLO。既往研究[2-3]顯示，氯硝柳胺在腫瘤細胞中可以通過顯著抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化而抑制腫瘤細胞的增殖。腎臟纖維化進展過程中，Wnt/β-Catenin信號通路也處于活化狀態，P-NICLO在腎臟組織纖維化過程中是否有類似抑制Wnt/β-Catenin信號通路的作用尚未可知。該研究旨在探討P-NICLO是否通過抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化而抑制腎臟組織纖維化。

1 材料與方法

1.1實驗動物與細胞雄性BALB/c小鼠，20～25 g，購自并飼養于安徽醫科大學實驗動物中心。大鼠腎小管上皮細胞株NRK-52E美國ATCC來源細胞株。該研究動物實驗經安徽醫科大學實驗動物中心倫理委員會批準(批準號：20170371)。

1.2主要試劑與儀器Wnt/β-Catenin信號通路相關抗體anti-β-Catenin、anti-active-β-Catenin (即anti-ABC)購自美國Millipore公司；抗纖溶酶原激活物抑制劑-1(plasminogen activator inhibitor-1，PAL1)即anti-PALI購自美國Santa Cruz公司；抗基質金屬蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7，MMP7)即anti-MMP7購自美國GeneTex公司；anti-Snai購自美國Cell signaling公司；Real-Time PCR儀(7500Fast)購自美國ABI公司；Bio-Rad電泳儀購自美國BIO-RAD公司；TRIzol 試劑及TaKaRa試劑盒(Cat.No:RR047A)購自美國Invitrogen公司。

1.3實驗動物及細胞模型建立

1.3.1動物模型及分組 雄性BALB/c小鼠20～25 g，行左側輸尿管結扎術后，隨機分為3組：Sham組、單側輸尿管梗阻模型(unilateral ureteral obstruction，UUO)組、UUO+P-NICLO組，每組5只。用藥組P-NICLO用0.9%氯化鈉注射液溶解，術天第7天開始30 mg/kg劑量腹腔注射，每日1次；UUO陽性對照組予以相應劑量的生理鹽水腹腔注射，術后第14天處死小鼠取組織。

1.3.2細胞模型及分組 大鼠腎小管上皮細胞NRK52E傳代分皿后，分組如下：① CTRL(Control)組：無血清DMEM/F12培養液培養24 h；② TGFβ1組：含10 ng/ml TGFβ1無血清DMEM/F12培養液培養24 h收取蛋白；③ P-NICLO藥物干預組：P-NICLO按照濃度梯度預處理細胞1 h后加TGFβ1 10 ng/ml繼續無血清DMEM/F12培養液培養24 h后收細胞。所有實驗重復3次。

1.4樣本制備

1.4.1動物實驗標本制備 所有小鼠術后第14天處死，處死小鼠時，左心室抽血，右心房切一小口，予以約20 ml冰PBS灌注左心室至腎臟蒼白色，收集兩側腎臟備用。取左側病變腎臟上極置于10%福爾馬林溶液中固定，4 ℃至少放置24 h后，脫水，石蠟包埋，做常規病理檢測。收集其余左側病變腎臟皮質部分，用液氮冷凍，轉移至-80 ℃保存備蛋白及組織RNA的提取。

1.4.2細胞實驗標本收集 Western及IP細胞裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白，行Western blot檢測纖維化相關指標：α-SMA、Fibronectin(FN)、CollagenI(COL1)以及β-Catenin信號通路相關指標：β-Catenin 、active-β-Catenin以及β-Catenin信號通路靶蛋白PAL1、MMP7、Snail等的表達。

1.5實驗方法

1.5.1光鏡 標本取出后 ，進行脫水，包埋，切片, Masson染色。腎臟皮質部位顯微鏡400×視野下隨機選取至少15個視野，然后應用Image pro-Plus6.0軟件，計算陽性染色區域的積分光密度(integrated option density,IOD)值，陽性染色區域的IOD/圖片總面積所得出的數值再進行統計學分析。

1.5.2Western blot 超聲震蕩打碎的腎臟組織或收集的細胞，用Western或IP裂解液冰上裂解30 min(裂解液中需加入一定比例的蛋白酶抑制劑)，提取總蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，后轉印至PVDF膜，5%BSA 室溫封閉2 h，按照說明書分別加入一定濃度的一抗及二抗封閉，加DAB 顯色液，曝光顯影并拍照保存，以GAPDH 為內參驗證蛋白含量。

1.5.3Real-time PCR 根據TRIzol試劑說明書及TaKaRa試劑盒說明書進行操用，具體步驟如下： TRIzol裂解液裂解組織或細胞，然后提取RNA并逆轉錄成CDNA，最后按照說明書依次將反應體系加入7500 Fast Real-time PCR的反應體系中，行PCR擴增檢測。動物實驗Real-time PCR引物：GADPH F：5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′；R：5′-CTC GCTCCTGGAAGATGGTG-3′；MMP7 F ：5′-TAGGCGG AGATGCTCACTTT-3′；R：5′-TTCTGAATGCCTGCAA TGTC-3′；PAL1 F：5′-GTTCATCGCTGCACCCTTTG-3′；R：5′-CTGCTCTTGGTCGGAAAGACT-3′；Snail F ：5′-ATTCTCCTGCTCCCACTGC-3′；R：5′-GACTCTTG GTGCTTGTGGAG-3′。

2 結果

2.1P-NICLO對腎臟纖維化的干預作用實驗過程中，小鼠無明顯厭食，腹瀉，活動度下降等不良反應，無發生死亡，提示P-NICO毒性相對較低。MASSON染色顯示UUO+P-NICLO組腎臟組織膠原纖維沉積明顯減輕，與UUO組比較差異有統計學意義。Western blot結果也表明，動物模型中UUO+P-NICLO組纖維化指標α-SMA、Fibronectin、CollagenI表達均顯著降低，與UUO組比較差異有統計學意義(圖1、表1)。細胞實驗進一步證實了上述論點，TGFβ1體外刺激NRK52E細胞，使其活化產生促纖維化因子，P-NICLO預處理細胞可以明顯下調纖維化相關蛋白的表達水平，與TGFβ1組比較差異有統計學意義(圖2、表2)。

A、B：各組小鼠腎臟皮質(MASSON染色×400)及其膠原纖維沉積的定量分析；C、D： Western blot檢測各組小鼠纖維化蛋白表達及其定量分析；與Sham組比較：*P<0.05；與UUO組比較：#P<0.05

表1 Western blot檢測各組動物腎臟組織纖維化蛋白的表達

與Sham組比較：*P<0.05；與UUO組比較：#P<0.05

表2 Western blot檢測各組NRK52E細胞促纖維化因子的表達

與CTRL組比較：*P<0.05；與TGFβ1組比較：#P<0.05

表3 Western blot檢測各組動物腎臟組織β-Catenin信號通路相關蛋白的表達

與Sham組比較：*P<0.05；與UUO組比較：#P<0.05

表4 Western blot檢測各組NRK52E細胞β-Catenin信號通路相關蛋白的表達

與CTRL組比較：*P<0.05；與TGFβ1組比較：#P<0.05

圖2 P-NICLO對 NRK52E細胞促纖維化因子表達的影響

2.2P-NICLO對腎臟纖維化β-Catenin信號通路的干預作用體內實驗(圖3、表3)及體外實驗(圖4、表4)都證實P-NICLO可以使總β-Catenin及活化的β-Catenin表達均顯著下調，進而抑制其下游信號通路的活化，使其靶基因(PALI1、MMP7、Snail)表達水平均顯著下調，與UUO組比較差異有統計學意義。

3 討論

腎臟纖維化是各種慢性腎臟病進展至ESRD的共同途徑，但目前臨床上尚缺乏有效抑制腎臟組織纖維化的藥物，如何更有效地抑制腎臟組織纖維化，延緩CKD進展至ESRD需要腎臟替代治療的時間無疑是當前腎臟病衛生戰略重點之一。

圖3 P-NICLO對UUO模型β-Catenin信號通路活化的影響

A、B：Western blots示各組小鼠β-Catenin信號通路相關蛋白的表達及其定量分析；C～E：Real-time PCR示各組小鼠β-Catenin信號通路靶基因PAL1(C)、MMP7(D)、Snail(E) mRNA水平的表達；與Sham組比較：*P<0.05；與UUO模型組比較：#P<0.05

圖4 P-NICLO對NRK52E細胞β-Catenin信號通路活化的影響

與CTRL組比較：*P<0.05；與TGFβ1組比較：#P<0.05

研究[4]顯示腎臟組織纖維化發生及進展涉及腎臟組織的所有細胞成分，如小管、小管間質、腎小球、血管內及募集到腎臟組織的骨髓源性細胞(如單核細胞、纖維細胞)等。腎臟組織纖維化是一個動態進展過程，包括啟動、活化、持續、進展等，在此過程中涉及多條信號通路及細胞因子的活化[1]。目前研究比較多的與腎臟組織纖維化相關的信號通路包括TGFβ/Smad信號通路、Wnt/β-Catenin信號通路、NF-κB信號通路、RASS信號通路等。這些信號通路在腎臟組織纖維化的發生及進展過程中均有不同程度的活化，參與調節腎臟組織纖維化發生及發展，且各條信號通路并不是孤立存在而是相互關聯相互影響，存在“串話”效應[1,5]，大量基礎實驗及臨床研究通過制備靶向抑制上述信號通路的藥物，用于抗腎臟纖維化治療，并已取得一定成效[6-7]。

該研究所涉及的Wnt/β-Catenin信號通路是一種經典的信號通路，在動物的生長發育及病理生理變化中發揮重要作用。在此信號通路中，β-Catenin是一種細胞骨架蛋白，與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、α-連環蛋白(α-catenin)等形成黏附復合體，在細胞-細胞黏附中起重要作用[8-9]。β-Catenin除形成復合體外，還是Wnt/β-Catenin信號轉導通路中關鍵調節因子。Wnt蛋白同時與跨膜卷曲蛋白受體Frizzled(Fzd)和低密度脂蛋白受體相關蛋白(LRP)結合，然后激活下游disheveled(Dsh)蛋白，Dsh活化后，進一步激活ZW3/GSK3,使β-Catenin磷酸化減少，無法及時降解而在胞質內堆積，過度堆積的β-Catenin可轉位入核，與核轉錄因子即T 細胞因子(TCF)/淋巴增強結合因子(LEF)結合組成復合物，再募集共活化因子環磷酸腺苷(cAMP)效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)結合蛋白(CBP)，從而激活Wnt/β-Catenin靶基因的轉錄，包括常見的Snail、PAL1、MMP7等[8]。細胞內β-Catenin水平是Wnt信號通路中的重要調節靶點。β-Catenin在細胞內的水平受正性調節因子和負性調節因子的競爭性調節，負性調節因子是由GSK/ZW3、Axin及APC一組蛋白組成的復合體，主要作用是破壞β-Catenin的穩定性，使β-Catenin在細胞內降解處于高水平，從而關閉Wnt途徑。正性調節因子包括另一類拮抗類的蛋白，包括Disheveled及TCF-Grouch-CBP等，在對Wnt信號反應時被活化，起拮抗破壞復合物的作用，使細胞內的β-Catenin水平升高，從而啟動Wnt信號[8-9]。

Wnt/β-Catenin信號通路在腎臟發育過程中處于活化狀態，腎臟發育成熟后處于靜止狀態，腎臟疾病時重新活化[8-9]。在很多腎纖維化模型中均可以發現Wnt/β-Catenin信號通路的激活，而選擇性的抑制這一通路可以明顯減輕腎臟纖維化。如近年來研究[9-10]顯示小分子肽類化合物ICG-001，可特異性的干擾Wnt/β-Catenin信號通路。ICG-001通過結合CBP從而干擾β-Catenin/CBP的相互作用，已經證明其在小鼠模型上能夠逆轉甚至阻斷腎臟纖維化，但只處于臨床前研究，需進一步驗證。Wnt/β-Catenin信號通路還可以直接調控RASS相關蛋白基因而影響腎臟病的進展。研究[10-11]表明選擇性抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化是腎臟纖維化治療的另一個重要靶點。

既往研究Wnt/β-Catenin信號通路特異性抑制物大多為新合成化合物，其性能及安全性還有待進一步驗證。本研究所涉及的藥物P-NICLO是FDA已批準用藥即氯硝柳胺的水溶性衍生物，該藥物在腎臟組織纖維化防治中的作用尚無相關研究。既往研究[12-13]氯硝柳胺藥理作用時顯示，在腫瘤細胞中，氯硝柳胺可以通過抑制β-Catenin信號通路的活性抑制腫瘤細胞的增生。Chen et al[12]發現在人類骨肉瘤U2OS細胞中，氯硝柳胺主要通過促進Wnt受體Fzd1內吞，抑制Wnt信號調節蛋白 Dsh的表達等多方面抑制β-Catenin信號通路；在人類結腸癌細胞系中，也發現類似作用[13]；但是在人類前列腺癌和乳腺癌細胞中，氯硝柳胺主要通過促進Wnt共受體LRP6的降解而抑制β-Catenin信號通路的活化，而對Dsh蛋白表達無影響；表明氯硝柳胺抑制β-Catenin信號通路的作用機制具有細胞特異性[13-14]。

該研究通過設計體內體外實驗證實腎臟纖維化模型中，P-NICLO可特異性抑制β-Catenin總蛋白及活化β-Catenin蛋白形成，進而抑制下游靶蛋白PALI1、MMP7、Snail等表達，最終抑制腎臟組織纖維化，為腎臟纖維化的防治提供新的思路。但P-NICLO如何抑制β-Catenin總蛋白及活化β-Catenin蛋白的形成，其抑制Wnt/β-Catenin信號通路的活化是否還有其他機制參與尚未可知，有待進一步研究證實。