KKAy小鼠聚合酶delta作用蛋白2缺乏導致血糖異常的研究

岳萍萍，陳可洋，孔德潤

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)合會的統(tǒng)計，2015年全球每11個成年人中就有1個患有糖尿病。肝臟是控制葡萄糖水平的主要靶器官之一，通過調(diào)節(jié)攝取和儲存過程以及葡萄糖的輸出來維持葡萄糖穩(wěn)態(tài)。在肥胖和糖尿病動物中存在“選擇性胰島素抵抗”，胰島素不能抑制肝臟糖異生卻可以激活脂肪的生成，導致糖脂代謝的紊亂。在肝臟中存在一個重要的調(diào)控機制就是對胰島素受體(insulin receptor，IR)、胰島素受體底物(insulin recetor substrate,IRS) 以及其他下游分子的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸化進行的可逆調(diào)節(jié)。其中有一個經(jīng)典的信號傳導通路就是通過胰島素/磷脂酰肌醇-3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)傳導通路來調(diào)節(jié)糖脂代謝。另一方面，IR可刺激NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4,NOX4)產(chǎn)生過氧化物自由基，之后抑制下游的10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN),而這種蛋白是胰島素信號轉導的主要負調(diào)控因子[1]。聚合酶delta作用蛋白2(polymerase delta-interacting protein 2,Poldip2)做為NOX4的積極監(jiān)管機構，能通過穩(wěn)定NOX4/p22phox復合物或增加應力纖維的結合位點來增強NOX4的活性，增加其氧化的功能[2]。該研究提出假設在2型糖尿病小鼠中可能由于Poldip2的缺乏，導致下調(diào)了活性氧(reactive oxygen spcies,ROS)減少過氧化氫(H2O2)的生成，大量的PTEN產(chǎn)生對胰島素信號通路起到負性調(diào)節(jié)的作用，從而改變了胰島素信號通路中的下游蛋白及產(chǎn)生糖代謝的紊亂。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑SPF級的7周雄性KKAy模型鼠45只(體質(zhì)量30～40 g)，以及7周C57BL/6J雄性小鼠12只(體質(zhì)量25～30 g)均購自北京華阜康生科技有限公司。H2O2試劑盒購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑購自美國Thermofisher公司；逆轉錄反應試劑RR037A、RT-PCR專用試劑RR820A均購自大連TaKaRa公司；引物購自上海捷瑞生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液(強)購自江蘇碧云天生物技術有限公司；Western blot 一抗β-actin 購自美國Sigma公司；Poldip2 購自美國Santa Cruz公司；NOX4、PTEN、磷酸化的10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源(phospho-phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，p-PTEN)、磷酸化的AKT絲氨酸473位點(phospho-Akt ser473,p-Akt 473)、磷酸化的AKT蘇氨酸308位點(phospho-Akt thr308,p-Akt308)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)均購自美國cell signling technology公司；Akt、Forkhead轉錄因子1(Forkhead box protein O1，F(xiàn)oxO1)、磷酸化的Forkhead轉錄因子1(phospho-Forkhead box protein O1，p-FoxO1) 均購自美國abcam公司；葡萄糖6磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)購自美國Thermofisher公司；Western blot二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2動物處理小鼠安置于安徽醫(yī)科大學動物中心，溫度控制在20～25 ℃，濕度控制在(50±5)%，維持室內(nèi)光照12 h/12 h。C57BL/6J小鼠喂養(yǎng)用普通基礎飼料，KKAy小鼠的喂養(yǎng)配合高脂飼料。動物被允許自由獲取食物和水。將45只KKAy小鼠經(jīng)過4周喂養(yǎng)后，隨機分成3組。GFP組(通過尾靜脈給予空載體GFP腺病毒4×1010Vp/鼠，n=16)；PBS組(通過尾靜脈注射等量的磷酸鹽緩沖鹽水，n=11)；Poldip2組(通過尾靜脈給予過表達Poldip2腺病毒5×1010Vp/鼠，n=18)。C57BL/6J小鼠尾靜脈注射等量的磷酸鹽緩沖鹽水(n= 12)作為正常對照組。 因在小鼠肝臟中腺病毒2～3 d達到最高峰，5 d后變化減少,故在第4天各組再追加注射1次，注射的方式以及劑量同前。各個組每周注射2次相應試劑，注射一周，小鼠空腹8 h，測量體質(zhì)量以及空腹血糖。先通過眼球取血的方式獲取血清。之后每個小鼠按60 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射3%的戊巴比妥麻醉，用生理鹽水胸腔灌注，待肝臟顏色變白后停止，取出肝臟。用1～2 g新鮮肝臟檢測H2O2，其余肝臟立即在液氮中快速冷凍并在-80 ℃下儲存。

1.3H2O2的檢測取新鮮肝臟在冰上操作按照每毫克加入20 ml裂解液，4 ℃、1 000 r/min離心5 min，留取上清液按照說明書操作。

1.4Westernblot用RIPA裂解液提取各組肝臟中組織總蛋白，采用BCA濃度測定試劑盒進行蛋白定量。之后每個樣品孔上10～20 μg蛋白。在SDS-PAGE凝膠上分離蛋白質(zhì)樣品并轉移到PVDF(0.2 μm)膜上；之后PVDF膜用TBST(Tween-20 / TBS)配的5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h；接著0.1%TBST(Tween-20/TBS)洗膜10 min；之后的膜與β-actin、Akt、p-Akt473、p-Akt308、PTEN、p-PTEN、FoxO1、p-FoxO1、PEPCK、NOX4、Poldip2和G6Pase等相應的一抗于4 ℃孵育過夜。膜再次用0.1% TBST(Tween-20/TBS)洗滌3次，每次10 min。洗滌后，將膜與二抗在室溫孵育約2 h。

1.5RT-PCR反應根據(jù)TRIzol試劑說明書,從100 mg冷凍肝中提取總RNA。總RNA的濃度通過微量分光光度計在260 nm和280 nm測量。然后嚴格按照說明書進行RT-PCR,測得Ct值。 以β-actin作為內(nèi)參照，用2-ΔΔCt法分析相關基因的表達。 PEPCK正向引物:5′-CTGGCACCTCAGTGAAGACA-3′,反向引物:5′-TCGATGCCTTCCCAGTAAAC-3′；G6Pase正向引物:5′-TTCTGGATGGTTCCCTGAAG-3′,反向引物:5′-ACCGCAAGAGCATTCTCAGT-3′;β-actin正向引物:5′-CTCTCCCTCACGCCATC-3′,反向引物:5′-ACGCACGATTTCCCTCTC-3′。

2 結果

2.1體質(zhì)量及血糖檢測經(jīng)過4周的喂養(yǎng)后，KKAy小鼠的體質(zhì)量為(36.34±1.05)g，與正常對照組C57BL/6J小鼠的體質(zhì)量(28.91±0.72)g比較，KKAy小鼠體質(zhì)量增加明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；KKAy小鼠的空腹血糖水平為(9.57±0.47)mmol/L,與正常對照組C57BL/6J小鼠的空腹血糖(6.41±0.20)mmol/L比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。之后根據(jù)處理不同分為4組進行干預1周，各組在干預1周后體質(zhì)量均未見明顯變化。Poldip2組干預前空腹血糖水平為(9.78±0.29)mmol/L，干預后血糖為(8.64±0.28)mmol/L，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明Poldip2可改善KKAy的血糖水平。

2.2肝臟H2O2的檢測小鼠新鮮肝臟中測H2O2，4組之間的H2O2水平差異有統(tǒng)計學意義(F=95.17，P<0.05)。與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，PBS組和GFP組的水平顯著降低(P<0.05)，而Poidip2組則無明顯變化。見圖1。

圖1 新鮮的肝臟中H2O2的水平

1：正常對照組；2：PBS組；3：GFP組；4：Poldip2組；與正常對照組比較：*P<0.05

圖2 4組小鼠的Poldip2、NOX4、PTEN及p-PTEN 的蛋白表達變化

A:肝臟中Poldip2、NOX4的表達;B:肝臟中PTEN及p-PTEN的表達； 1：正常對照組；2：PBS組；3：GFP組；4：Poldip2組；與正常對照組比較：*P<0.05

2.3Poldip2對于胰島素信號通路中蛋白表達的影響

2.3.1肝臟中Poldip2、NOX4、PTEN及p-PTEN的表達 與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，KKAy小鼠中的PBS組和GFP組Poldip2、NOX4的蛋白表達被顯著抑制(P<0.05)；而與PBS組、GFP組比較，Poldip2組的Poldip2、NOX4表達水平明顯上升(P<0.05)。與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，PBS組和GFP組PTEN與p-PTEN的比值顯著降低(P<0.05)。與PBS組、GFP組比較，Poldip2組中PTEN與p-PTEN的比值升高至正常水平。見圖2。

2.3.2肝臟組織中Akt、FoxO1及p-FoxO1的表達 與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，其余3組中總Akt蛋白表達水平無明顯變化，但PBS組和GFP組中的p-Akt473和p-Akt308表達顯著降低(P<0.05),Poldip2組的p-Akt473和p-Akt308則上升至正常水平。PBS組和GFP組的FoxO1和p-FoxO1的比值顯著高于正常對照組C57BL/6J小鼠(P<0.05)，但Poldip2組的比值則無明顯變化。見圖3。

2.3.3肝臟組織中G6Pase及PEPCK的表達 與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，PBS組和GFP組中的表達顯著升高(P<0.05)。而與PBS組、GFP組比較，Poldip2組中的PEPCK和G6Pase顯著降低(P<0.05)。見圖4。

2.4肝臟組織中G6Pase、PEPCK的mRNA表達水平通過RT-PCR來了解這4組肝臟中PEPCK和G6Pase的mRNA表達。 結果顯示，與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，PBS組和GFP組PEPCK和G6Pase mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)，但Poldip2組的 mRNA表達水平卻無明顯變化，與PBS組和GFP組比較，Poldip2組的PEPCK和G6Pase mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)。這與Western blot的結果一致。見圖5。

3 討論

Poldip2是與人DNA聚合酶delta和增殖細胞核抗原的小亞基p50相互作用的。研究[3]表明Poldip2與DNA復制和修復，線粒體功能和延伸以及細胞黏附受體的下游信號有關。在目前的研究中，國內(nèi)外對于Poldip2大多與NOX4相聯(lián)系，而對于代謝性疾病如糖尿病的研究甚少。本研究結果表明提高糖尿病小鼠的Poldip2可明顯改善血糖水平，從而提示Poldip2可能成為治療糖尿病的一個新靶點。

肝臟中有多個細胞信號傳導通路參與血糖的調(diào)節(jié)。其中有比較經(jīng)典的胰島素/PI3K/Akt信號傳導通路。在正常生理狀態(tài)下，胰島素與其受體結合發(fā)生自動磷酸化，激活細胞內(nèi)IRS家族磷酸化。繼而激活PI3K，導致3、4、5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)的產(chǎn)生[4]。 此時位于Akt激酶上的蘇氨酸308位點被磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1磷酸化。同時Akt上的絲氨酸473位點也發(fā)生磷酸化，從而完全催化激活Akt[5]。激活的Akt調(diào)節(jié)其下游蛋白質(zhì)，其中有FoxO1[6]。FoxO1被磷酸化后活性下降，從而導致下游的糖異生關鍵酶活性降低，阻斷糖異生途徑[4,7]。IR同時可刺激NOX4抑制PTEN， 其抑制機制依賴于半胱氨酸的氧化[8]。 即Poldip2功能的喪失會抑制NOX4活性，從而導致過氧化物減少，導致下游的PTEN增加，PTEN通過去磷酸化Akt，降低其活性，對胰島素信號傳導途徑的上游成分起到負面影響[9]，從而影響胰島素信號的傳導。

圖3 4組小鼠的Akt、FoxO1及p-FoxO1蛋白的表達變化

A:肝臟組織中Akt的表達;B:肝臟組織中FoxO1及p-FoxO1的表達1：正常對照組；2：PBS組；3：GFP組；4：Poldip2組；與正常對照組比較：*P<0.05

圖4 4組小鼠G6Pase、PEPCK蛋白表達變化

A:G6Pase;B:PEPCK; 1：正常對照組；2：PBS組；3：GFP組；4：Poldip2組；與正常對照組比較：*P<0.05

圖5 4組小鼠G6Pase、PEPCK mRNA表達的變化

A:G6Pase mRNA;B:PEPCK mRNA; 1：正常對照組；2：PBS組；3：GFP組；4：Poldip2組；與正常對照組比較：*P<0.05

實驗結果表明，與正常對照組C57BL/6J小鼠比較，KKAy小鼠H2O2水平顯著下降，而注射Poldip2腺病毒后，KKAy小鼠的H2O2水平得到了明顯上升。同時PBS組和GFP組的NOX4、Poldip2、PTEN、p-Akt473、p-Akt308、p-FoxO1蛋白的表達水平較正常對照組下降，但p-PTEN、FoxO1、PEPCK、G6Pase較正常對照組上升。Poidip2組的結果表明NOX4、 Poldip2、PTEN、p-Akt473、p-Akt308、p-FoxO1蛋白的表達水平較PBS組、GFP組上升，但p-PTEN、FoxO1、PEPCK、G6Pase較PBS組和GFP組下降。表明Poldip2可能抑制PTEN從而增強Akt活性。即通過PTEN/Akt/FoxO1通路下調(diào)PEPCK和G6Pase活性減少糖異生，從而改善糖代謝成為胰島素信號通路的一個正調(diào)節(jié)因素。綜上所述，Poldip2能夠改善2型糖尿病鼠的糖代謝機制可能是通過升高Poldip2的表達，激活NOX4產(chǎn)生H2O2，抑制了PTEN活性，從而提高Akt活性，達到改善胰島素信號通路及糖代謝的紊亂的效果。