4-NQQ誘導(dǎo)小鼠舌癌形成過程中的血清差異蛋白篩選

李 邦，王 飛，張亞軍，劉來奎，孫應(yīng)明

全球每年約35萬人被診斷為口腔癌，其中舌癌約占40%左右，為最常見的口腔癌[1]。近年來舌癌的發(fā)病率有上升趨勢，且其早期診斷困難并伴有高轉(zhuǎn)移率，所以盡管最近提出了很多新的治療方法，但患者的5年生存率一直未見明顯的提高，僅50%左右[2]。因此尋找舌癌的早期診斷標(biāo)志物以及探索舌癌形成的機(jī)制變得越來越重要。目前舌癌的發(fā)病機(jī)制尚不明了，研究[3]表明長期的小劑量接觸致癌物導(dǎo)致基因突變可引起組織發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化而發(fā)生癌變。其中蛋白組學(xué)技術(shù)能全面地檢測生物體全部蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式，并且在腫瘤的早期篩選、探索腫瘤治療的新靶點(diǎn)中發(fā)揮重要的作用。在致癌物4-硝基喹啉-1-氧化物(4-NQQ)誘導(dǎo)舌癌模型中，整個實(shí)驗(yàn)歷時較長，經(jīng)歷小鼠生長發(fā)育的整個時期，與人類舌黏膜癌變過程相類似，能很好地模擬人舌癌形成的過程[3]。該研究采用4-NQQ誘導(dǎo)小鼠舌黏膜癌變，然后取3個特定時間點(diǎn)小鼠血清行蛋白組學(xué)分析，篩選舌癌形成過程中其血清的差異表達(dá)蛋白，以期篩選出舌癌早期診斷的腫瘤標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物及舌癌模型誘導(dǎo)100只C57BL/6小鼠(雌雄隨機(jī))，SPF級，鼠齡6～8周，購自南京醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。將100只小鼠隨機(jī)分為10組，每組10只。在10組小鼠中，隨機(jī)挑選5組為實(shí)驗(yàn)組，5組為對照組。實(shí)驗(yàn)組飲用水中加入4-NQQ，濃度為0.004%，對照組小鼠正常飼養(yǎng)。分別在8、12、16、20、24周時處死小鼠，取舌頭。右心室取小鼠靜脈血，1 000 r/min離心20 min，取上清血清，-80 ℃保存，避免反復(fù)凍融。

1.2小鼠舌黏膜組織病理學(xué)觀察在特定時間點(diǎn)處死小鼠后取舌頭，浸泡在4%多聚甲醛中，脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。舌癌的組織學(xué)分析：在雙盲實(shí)驗(yàn)中，兩名病理醫(yī)師為小鼠舌黏膜病變程度打分，使用如下打分系統(tǒng)：0=無改變；1=輕度異型增生，上皮的紊亂及細(xì)胞異型局限在上皮下1/3；2=中度異型增生，上皮紊亂及細(xì)胞異型局限在上皮的中1/3；3=重度異型增生，上皮的紊亂及細(xì)胞異型超過上皮的2/3；4=浸潤癌，腫瘤細(xì)胞突破基底膜沿舌肌向下浸潤。

1.3iBT定量蛋白組學(xué)分析在小鼠舌黏膜出現(xiàn)典型病變時取小鼠靜脈血清即在8周(舌黏膜開始出現(xiàn)異常時)、16周(輕度異型增生)、24周(開始出現(xiàn)浸潤癌)時。隨機(jī)取其中5只小鼠血清混合后(滿足iBT實(shí)驗(yàn)所需，剩余血清進(jìn)行其他實(shí)驗(yàn))行iBT定量蛋白組學(xué)分析(深圳華大基因)，血清蛋白按如下步驟進(jìn)行分析：蛋白提取、蛋白酶解、肽段標(biāo)記、肽段分離、質(zhì)譜檢測。原始數(shù)據(jù)獲得后進(jìn)行如下分析：選擇蛋白數(shù)據(jù)庫、Mascot(版本為Mascot2.3.02)搜索使用、蛋白iBT定量、差異蛋白通路富集分析。當(dāng)?shù)鞍撞町悵M足差異比值>1.5及P<0.05時，認(rèn)為該蛋白為差異蛋白。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理差異蛋白統(tǒng)計學(xué)分析使用IQuant軟件(華大基因)，IQuant顯示蛋白差異有統(tǒng)計學(xué)意義是根據(jù)Benjamini-Hochberg計算法中的多重假設(shè)分析。

2 結(jié)果

2.1舌癌模型誘導(dǎo)為了探索舌癌形成過程中，血清蛋白表達(dá)的變化，為舌癌的治療及早期診斷提供依據(jù)。在小鼠的飲用水中加入4-NQQ誘導(dǎo)小鼠舌黏膜癌變。在成瘤實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠在16周時開始出現(xiàn)活動性下降，20周時小鼠成堆蜷縮在籠子一角，厭食，活動減少，且1只實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡(死亡原因不明)，24周時小鼠毛發(fā)稀疏無光澤，頦部可見食物碎屑結(jié)痂且潮濕，部分小鼠呈惡病質(zhì)狀瀕死狀，部分小鼠體重僅16 g左右。小鼠舌外觀8周時開始出現(xiàn)鄒縮、粗糙，20周時開始出現(xiàn)疣狀物凸起及白斑，24周時小鼠出現(xiàn)疣狀物凸起的比例增加，且單個舌頭上疣狀物的數(shù)量増多(圖1 A)。病理學(xué)結(jié)果如下：其中8周時10只小鼠舌黏膜均無明顯異型增生，但部分小鼠舌黏膜出現(xiàn)增生及過角化；12周時70%出現(xiàn)輕度異型增生；16周時100%出現(xiàn)輕度異型增生；20周時33.33%出現(xiàn)輕度異型增生，44.44%出現(xiàn)中度異型增生，22.22%出現(xiàn)重度異型增生。24周時10%小鼠出現(xiàn)浸潤癌，10%重度異型增生，60%中度異型增生，20%輕度異型增生(圖1 B、表1)。

2.2iBT定量蛋白組學(xué)分析兩個對比組即8周/16周和16周/24周共發(fā)現(xiàn)差異蛋白194種，其中8周/16周共檢測到89種差異蛋白，其中62種上調(diào)蛋白，27種下調(diào)蛋白，16周/24周共檢測到105種差異蛋白，其中43種上調(diào)蛋白，62種下調(diào)蛋白(圖2 A)。其中差異蛋白通路富集分析提示：RAS信號通路、NF-κB通路、PI3K信號通路、Pathway in cancer信號通路、Proteoglycans in cancer信號通路、JAK-STAT信號通路、microRNA in cancer信號通路在舌癌形成過程中持續(xù)異常。在8周和16周對比組中發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)蛋白：纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)和原肌球蛋白1(tropomyosin 1，TPMI)低表達(dá)。在16周和24周的對比組中發(fā)現(xiàn)癌相關(guān)蛋白Four and a half LIM domains protein 1(FHL1)、FN、熱休克蛋白(heat shock protein 84b，HSP 84b)、serine/threonine-protein (PP2A)、蛋白聚糖 4(Proteoglycan 4，ECM)、14-3-3 protein gamma subtype and MCG126220 and Tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein(14-3-3)低表達(dá)(圖2B、表2)。

圖1 4-NQQ誘導(dǎo)小鼠舌黏膜癌變

異型增生登記8周實(shí)驗(yàn)組對照組12周實(shí)驗(yàn)組對照組16周實(shí)驗(yàn)組對照組20周實(shí)驗(yàn)組對照組24周實(shí)驗(yàn)組對照組01010310010010010100701003020200000040603000000201040000000010合計1010101010109101010

表2 蛋白組學(xué)結(jié)果：3個時間點(diǎn)兩個對比組的差異蛋白

3 討論

舌癌作為最嚴(yán)重的口腔疾病，但是常常被人認(rèn)為是其他口腔疾病如口腔潰瘍、舌腫塊等而被忽視，由于其早期轉(zhuǎn)移率高，大多數(shù)在確診時常常已發(fā)生了頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，給治療帶來很大的困難。并且由于其缺乏早期診斷標(biāo)志物，且常常被忽視，因而早期發(fā)現(xiàn)并診斷舌癌變得異常困難。

蛋白組學(xué)技術(shù)具有高敏感性和特異性，能廣泛地分析鑒定蛋白質(zhì)，在腫瘤的特異性標(biāo)志物的篩選及腫瘤形成機(jī)制的研究中發(fā)揮著越來越重要的作用。血液是臨床體檢、疾病篩查等工作中常見的樣本，其中血清中含有大量的免疫球蛋白和異質(zhì)組織蛋白，在使用血清作為臨床篩選腫瘤的工作中已取得大量進(jìn)展，在早癌的篩查中扮演越來越重要的作用。

圖2 iBT定量蛋白組學(xué)結(jié)果

A：兩個對比組差異蛋白總覽；B：腫瘤相關(guān)的差異蛋白各時間點(diǎn)變化折線圖

因此課題組使用4-NQQ誘導(dǎo)舌癌模型，在特定的時間點(diǎn)取小鼠血清行蛋白組學(xué)分析，希望能篩選出有利于舌癌早期診斷的標(biāo)志性蛋白質(zhì)。在小鼠舌癌模型誘導(dǎo)方面，整個實(shí)驗(yàn)耗時6個月，模型誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時小鼠開始出現(xiàn)浸潤性舌癌，但浸潤癌出現(xiàn)的比例不高，主要是由于小鼠狀態(tài)不佳，部分惡病質(zhì)體重僅16 g左右，呈現(xiàn)瀕死狀態(tài)，因而不得已結(jié)束小鼠舌癌誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中使用小劑量致癌物長期刺激小鼠舌黏膜，且經(jīng)歷了小鼠生長發(fā)育的整個時期(性成熟期至中老年期)，小鼠的舌黏膜病理改變從輕度異型增生到中度異型增生，然后為重度異型增生，最后發(fā)展為浸潤癌，該過程與人類舌癌的形成過程相類似，能很好地模擬人舌癌的形成過程與誘因[4]。

蛋白組學(xué)分析一共發(fā)現(xiàn)差異蛋白194種，其中8周/16周共檢測到89種差異蛋白，其中62種上調(diào)蛋白，27種下調(diào)蛋白，16周/24周共檢測到105種差異蛋白，其中43種上調(diào)蛋白，62種下調(diào)蛋白。其中癌相關(guān)蛋白FHL1、FN、HSP 84b、PP2A等在舌癌形成的過程中有明顯差異，未有文獻(xiàn)明確報道其能作為舌癌的早期診斷標(biāo)志物。但有多篇文獻(xiàn)[5-8]報道指出它們在腫瘤形成過程中表達(dá)紊亂。例如FHL1為腫瘤形成過程中的抑制劑，在腫瘤的形成和進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用，蛋白組學(xué)的結(jié)果提示其在舌癌形成的過程中對比8周持續(xù)低表達(dá)[5]?；|(zhì)及細(xì)胞中的FN能預(yù)測舌癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)歸，當(dāng)其在腫瘤基質(zhì)中低表達(dá)時舌癌的預(yù)后較好，結(jié)果提示其在小鼠舌癌形成的過程中低表達(dá)[6]。HSP27在舌癌的原發(fā)灶中的表達(dá)量與腫瘤的低分化關(guān)系密切，且其高表達(dá)提示患者有個良好的預(yù)后，蛋白組學(xué)的結(jié)果提示HSP 84b在舌癌形成中低表達(dá)[7]。PP2A被報道其有可能作為腫瘤的抑制器，蛋白組學(xué)的結(jié)果提示其在舌癌中高表達(dá)，特別是在腫瘤形成的最后階段即16至24周時[8]。通路分析結(jié)果提示癌相關(guān)通路如：NF-κB通路、PI3K信號通路、JAK-STAT信號通路等信號通路在舌癌的免疫治療被廣泛應(yīng)用[9-10]。由于蛋白質(zhì)學(xué)僅僅是初步篩選未能驗(yàn)證，因此課題組下一步計劃在人舌癌及正常組織標(biāo)本中驗(yàn)證蛋白組學(xué)中檢測的蛋白質(zhì)如FHL1、FN、HSP 84b、PP2A等，且對蛋白組學(xué)中檢測到的可能的異常通路進(jìn)行驗(yàn)證，進(jìn)一步揭示舌癌形成的機(jī)制，為舌癌的早期診斷提供新的標(biāo)志物。