新型硫化氫供體GYY4137對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用

胡麗，饒婷，段丹，段菲，黃焱瓊，蔣品

(1.英山縣人民醫院麻醉科，湖北 黃岡 438700；2.武漢大學人民醫院泌尿外科，湖北 武漢 433000)

缺血再灌注損傷(IRI)是臨床上比較常見的病理生理過程，經常發生于失血性休克、腎移植、大血管手術等[1]。其機制比較復雜，可能與氧化應激、鈣離子超載、炎性因子參與、細胞凋亡、一氧化氮含量變化等多因素有關。硫化氫(H2S)是近年來發現繼一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)之后的第三種內源性氣態信號分子，在體內以H2S/硫氫化鈉(NaHS)的形式保持動態平衡[2]。GYY4137作為一種新型的H2S供體，在生理的pH和溫度條件下可緩慢分解和釋放H2S[3]。因此，本研究旨在研究GYY4137在腎臟IRI過程中的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗試劑及器材GYY4137為Sigma 公司產品；血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)為美國貝克曼LX20型全自動生化分析儀檢測；丙二醛(MDA)、超氧化物岐化酶(SOD)檢測試劑盒為南京建成生物工程研究所生產；原位細胞凋亡檢測試劑盒為德國羅氏生物技術有限公司生產； RNA提取試劑盒及反轉錄試劑盒為威佳科技有限公司生產。

1.2實驗動物與分組研究時間為2015年6月至2016年6月。健康雄性成年Wistar大鼠45只，體質量250～300 g，購于湖北省疾病預防控制中心，所有實驗均獲武漢大學動物實驗倫理委員會批準。所有動物飼養在飼養于武漢大學人民醫院實驗動物中心，自由進食、進水。大鼠按隨機數字表法分為以下3組，每組15只：(1)對照組(A組)：以2%濃度戊巴比妥鈉，50 mg·kg-1腹腔注射麻醉，暴露左側腎臟，僅游離左側腎蒂，不給予任何干預措施，暴露45 min 后縫合切口;(2) 缺血再灌注(B組)：使用無損傷動脈夾閉左側腎蒂，45 min后取下動脈夾再灌注，肉眼觀察腎臟由暗紅色變為鮮紅色，說明腎臟再灌注成功，縫合切口關腹；(3)缺血再灌注+GYY4137組(C組)：手術方法同B組保持一致，再灌注同時腹腔注射GYY4137(100 μmol·kg-1)。

1.3取材與標本制備所有大鼠在灌注后24 h，快速脫頸椎法處死所有大鼠，快速采集左側腎臟組織標本。一半組織固定于4%多聚甲醛用于組織學檢查，另一半組織放置液氮中冷凍后轉入-80 ℃冰箱保存。

1.4蘇木精和伊紅(HE)染色用生理鹽水將左側腎臟組織沖洗干凈后，置于4%的甲醛溶液中固定，常規石蠟包埋，常規石蠟包埋后4 μm厚切片，經脫蠟、水化，HE染色后封片。

1.5血液Scr、BUN、SOD、MDA測定采集各組的血液標本，用生化分析儀測定各組Scr、BUN含量。MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法，操作按照說明書指示進行。

1.6細胞凋亡檢測生精細胞凋亡檢測采用末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)法，細胞核染成棕黃色者為TUNEL陽性細胞，光鏡下(×200)每張切片選取10個視野。生精細胞的凋亡指數(AI)=陽性細胞數/細胞總數×100%。

1.7反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR) 采用Trizol法提取腎臟組織樣本總RNA，依產品說明書取RNA 1 μg反轉錄成cDNA。反應條件為：反轉錄50 ℃ 15 min，95 ℃ 40 s；循環條件為：92 ℃ 30 s、55 ℃ 15 s、70 ℃ 45 s，40個循環(預變性，變性，退火，延伸)。引物序列：caspase-3正義鏈5′-TGGACTGCGGTATTGAGACA-3′，反義鏈5′-GCGCAAAGTGACTGGATGAA-3′；Bax正義鏈5′TGAACTGGACAACAACATGGAG3′，反義鏈5′AGCAAAGTAGAAAAGGGCA-ACC3′；Bcl-2正義鏈5′TTTGATTTCTCCTGGCTGTCT3′，反義鏈5′CTGATTTGACCATTT GCCTG3′；GAPDH正義鏈5′TGCTATGTTGCCCTAGAC3′，反義鏈5′GTTGGCATA GAGGTCTTTACGG3′。實驗測定所得Ct值即為mRNA表達水平，用2-△△Ct法得出各組樣品mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1腎臟組織的病理學改變A組未見明顯的組織病理學改變，腎小管上皮細胞無變性壞死；B組可見腎小管擴張和充血，腎小管上皮細胞水腫和壞死；與B組相比，C組可見腎小管上皮細胞損傷減輕，可見部分腫脹、變性和細胞脫落。見圖1。

2.2腎臟組織中Scr、BUN、MDA、SOD含量的變化B組中MDA、Scr、BUN含量較A組明顯增加，GYY4137治療后，C組的MDA、Scr、BUN含量較B組顯著降低(P<0.05)，B組，C組和A組比較均差異有統計學意義(P<0.05)；與A組相比，B組SOD活性明顯降低，GYY4137治療后增加了腎臟組織中SOD的活性， C組較B組活性顯著增加(P<0.05)，B組，C組和A組比較均差異有統計學意義(P<0.05)，具體數據見表1。

2.3腎小管上皮細胞凋亡情況A組可見較少的、散在的腎小管上皮細胞凋亡，凋亡指數(4.58±0.43)%；B組中凋亡細胞顯著增加，染色陽性細胞以遠端腎小管上皮細胞多見，凋亡指數為(23.52±1.87)%，與A組相比差異有統計學意義(P<0.05)；C組細胞凋亡較B組明顯減少，凋亡指數為(10.86±0.87)%，差異有統計學意義(P<0．05)。見圖2。

2.4腎臟組織中Bax、Bcl-2和caspase-3mRNA的表達水平Bax、caspase-3在B組中的mRNA表達水平，與A組比較顯著增加，GYY4137治療后，Bax、caspase-3在C組中的mRNA表達水平較B組有所降低，B組，C組和A組比較均差異有統計學意義(P<0.05)；Bcl-2在A組中mRNA表達水平明顯高于B組和C組，B組，C組和A組比較均差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

3 討論

H2S已被證實是一種有效的分子，在腎臟IRI過程中具有保護作用[4]。目前為止，在廣泛的生物和藥理實驗中，NaHS通常作為H2S的供體，在水中溶解后短時間內釋放出大量的H2S，很難達到持續穩定的治療效果[3]；而GYY4137作為一種新型的H2S供體，其特點是緩慢釋放H2S并能維持相對穩定的濃度，可更加有效的模擬體內H2S的釋放過程[5]。Meng等[6]研究發現GYY4137處理后，可明顯增加心臟射血分數，減少缺血面積，從而對IRI大鼠心肌產生保護作用;Tang等[7]報道了GYY4137在大鼠急性肺損傷的病理過程中發揮抗炎的作用。本實驗通過組織學觀察可見IRI組出現明顯的病理學和形態學上的變化，經GYY4137治療后明顯改善了腎臟IR組織學損傷。

氧化應激是內源性促氧化因子及反應活性氧(ROS)的過度產生，為眾多疾病致細胞功能障礙及組織損傷的病理生理機制[8-9]。IRI過程中伴有ROS的產生，而后者促進了IRI引起的損傷。正常情況下，SOD是體內重要抗氧化酶，能通過消除多余的ROS起到細胞保護作用，其抗氧化能力可改善IRI； MDA是脂質過氧化反應的穩定終產物，通常用來評價氧化應激條件下細胞的損傷程度[10]。BUN和Scr是人體內代謝的產物，是評價腎功能常用的指標。腎功能損傷后，腎小球濾過率下降，腎臟失去代償能力，將導致后血液中BUN、Scr升高。本研究表明，GYY4137處理后可明顯使IRI腎臟組織中氧化應激水平降低，從而減輕腎臟功能的損傷。

越來越多的研究表明，細胞凋亡在腎臟IRI的病理過程中有重要的作用[11]。IRI可刺激內皮細胞炎癥信號級聯反應，釋放氧自由基，使機體ROS過度生成，最終導致細胞特異性凋亡，使機體發生損傷[12-13]。很多研究指出細胞凋亡的途徑主要有內在(線粒體)和外在(死亡受體)兩條信號轉導通路[14-15]。在腎臟IRI過程中，誘導細胞凋亡的主要是線粒體信號轉導通路。正常情況下，caspase-3一般以酶原的形式存在，是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶中重要的組成部分，同時也是最關鍵的下游凋亡蛋白酶的匯聚點[16]。當細胞接受凋亡刺激時，caspase-3被激活，通過信號轉導引起細胞底物的降解而誘導凋亡[17-18]，其激活是通過一系列的信號轉導通路之間的相互作用決定的，其中抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax起到了關鍵的作用[19]，其變化是細胞凋亡損傷中另一個重要的因素[20]。本實驗IRI組中，凋亡水平明顯高于對照組；經GYY4137治療后，凋亡水平顯著降低。以上實驗結果表明GYY4137在腎臟IRI過程中發揮抗凋亡的作用。

表1 腎臟組織中Scr、BUN、MDA、SOD含量的變化

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05

圖3腎臟組織中Bax、Bcl-2和caspase-3 mRNA的表達水平

綜上所述，GYY4137可發揮抗凋亡和抗氧化作用，從而在腎臟組織IRI過程中發揮功能恢復的作用。雖然GYY4137的保護作用所涉及的機制仍有待充分闡明，但GYY4137可以代表一個易于使用的、安全的、有效的新方法，對損傷的腎臟進行保護。