熒光猝滅法研究二氫槲皮素和二氫楊梅素與牛血清白蛋白的相互作用

樊超，鐘藝青，粟蕓，李會娟，吳方評，金蘋

(湖南醫(yī)藥學(xué)院，湖南 懷化 418000)

二氫槲皮素別名花旗松素、紫杉葉素、黃杉素、雙氫櫟精，是藥用植物中存在的一種重要的二氫黃酮醇類化合物，屬于維生素PP族。研究表明，二氫槲皮素具有抗腫瘤[1-3]、抗氧化[4-5]、抗病毒[6-7]和抗心血管系統(tǒng)疾病等生物活性作用，在藥品、保健品、食品、煙草等行業(yè)中有廣泛的應(yīng)用。二氫楊梅素也是一種重要的二氫黃酮醇類化合物，研究表明，其具有抗腫瘤[8-10]、抗氧化[11]、抗炎[12]、解酒護(hù)肝[13]、抗病原微生物[14]、降血糖[15]、抗疲勞和調(diào)血脂等方面的作用。兩種二氫黃酮醇的結(jié)構(gòu)非常相似(圖1)，本實驗擬用光譜法研究二氫槲皮素和二氫楊梅素與血清白蛋白(BSA)作用機制，以了解它們在人體內(nèi)的儲存、轉(zhuǎn)運、代謝等情況，同時對兩種二氫黃酮醇的深入開發(fā)也具有重要意義。

注：A為二氫槲皮素；B為二氫楊梅素

圖1兩種成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 材料與方法

1.1儀器與試劑熒光分光光度計F-7000(日本日立公司)；UV-4802型紫外分光光度計(UNIC公司)；牛血清白蛋白(BSA)(Amresco，相對分子量65 000)5.0 ×10-5mol·L-1(即稱取約0.032 5 g BSA晶體溶于二次蒸餾水并定容至10 mL)，使用前配成1×10- 6mol·L-1；二氫槲皮素 (貴州迪大生物有限公司，純度≥98%，批號：GZDD-0121)使用前用無水甲醇配成1×10-6、2×10-6、3×10-6、4×10-6、5×10-6、6×10-6、7×10-6、8×10-6、9×10-6、10×10-6mol·L-110種不同濃度的溶液；二氫楊梅素(貴州迪大生物有限公司，純度≥98%，批號：480-18-2)使用前用無水甲醇配成0.9×10-6、1.8×10-6、2.7×10-6、3.6×10-6、4.5×10-6、5.4×10-6、6.3×10-6、7.2×10-6、8.1×10-6、9.0×10-6mol·L- 110種不同濃度的溶液；0.1 mol·L-1(pH=7.3)Tris-HCl緩沖溶液；0.5 mol·L-1NaCl水溶液；實驗所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水(電導(dǎo)率1.7 mS·cm-1)。

1.2實驗條件的優(yōu)選(1)BSA的濃度范圍：實驗表明BSA濃度在1.20 ×10-7～2.00 ×10-6mol·L-1范圍內(nèi)，熒光強度與其濃度成正比，故實驗中BSA濃度選擇1.0 ×10-6mol·L-1；(2)緩沖介質(zhì)的選擇：測試了BSA在Tris-HCl、Na2B4O7-H3BO3和Na2HPO4-NaH2PO4三種緩沖溶液中的熒光穩(wěn)定情況，發(fā)現(xiàn)BSA在Tris-HCl緩沖溶液中穩(wěn)定性較好，因而選定Tris-HCl作為實驗的緩沖作用溶液；(3)pH 的影響：在Tris-HCl緩沖溶液中，pH于4.0～9.0范圍內(nèi)測定BSA的熒光光譜，發(fā)現(xiàn)pH在6.0～7.5范圍內(nèi)BSA熒光強度相對穩(wěn)定，所以選擇與人體體液相近的pH=7.3;(4)離子強度的影響：NaCl濃度在0.10～0.35 mol·L- 1范圍內(nèi)對BSA熒光強度影響不太明顯，因而實驗選定0.10 mol·L- 1的NaCl溶液作為測定BSA熒光時的離子強度。

1.3熒光光譜的測定在選定條件下， 10支10 mL比色管中分別加入1 mL Tris-HCl緩沖液、1 mL 0.5 mol·L-1的NaCl溶液、1 mL二次蒸餾水、0.1 mL 5×10-5mol·L-1BSA溶液和不同濃度的二氫黃酮溶液，用甲醇定容至5 mL，將比色管分別置于18、25、30 ℃的水浴鍋中反應(yīng)5 min，設(shè)定激發(fā)狹縫寬度為2.5 nm、發(fā)射狹縫寬度為5 nm，掃描速度為1 200 nm·min-1，在激發(fā)波長為280 nm的激發(fā)下，于290～450 nm范圍內(nèi)掃描，分別得到二氫槲皮素和二氫楊梅素的熒光猝滅光譜(見圖2和圖3)。

2 結(jié)果

2.1熒光光譜的研究在BSA中，由于色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸三種芳香族氨基酸的存在，故使BSA存在內(nèi)源熒光，而色氨酸的熒光強度大于其他兩種，所以BSA熒光強度的變化可直接反映色氨酸殘基及其周圍環(huán)境的變化。以不同濃度的二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA的作用體系來看，隨著兩種二氫黃酮濃度的增加，在341 nm左右兩種體系的熒光發(fā)射強度均出現(xiàn)有規(guī)律的被猝滅現(xiàn)象，且最大發(fā)射波長均有一定程度的藍(lán)移情況。說明兩種小分子二氫黃酮醇引入后與BSA發(fā)生了結(jié)合反應(yīng)，并生成了熒光較弱或不發(fā)熒光的物質(zhì)。

2.2熒光猝滅類型的判斷熒光的猝滅類型分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動態(tài)猝滅可用動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv來描述猝滅劑與熒光物質(zhì)之間的相互作用的程度及性質(zhì)；靜態(tài)猝滅可用靜態(tài)結(jié)合常數(shù)K來描述猝滅劑與熒光物質(zhì)之間相互作用的程度和性質(zhì)。

激發(fā)態(tài)時猝滅劑與熒光物質(zhì)分子之間的相互作用過程可通過動態(tài)猝滅得到反映，其作用規(guī)律遵循Stern-Volmer方程:

F0/F=1+KQτ0CQ=1+KsvCQ

式中：F0為未加入猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強度；F為猝滅劑濃度等于CQ時熒光物質(zhì)的熒光強度；KQ為雙分子猝滅過程的速率常數(shù)；τ0為沒有猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命;Ksv為Stern-Volmer雙分子猝滅速率常數(shù)，看作是雙分子猝滅速率常數(shù)與單分子衰變速率常數(shù)的比率。

靜態(tài)猝滅則可認(rèn)為是基態(tài)時猝滅劑與熒光物質(zhì)生成熒光較弱或不發(fā)熒光的復(fù)合物，可用下列方程來描述：

F0/F=1+KCQ

式中：K為基態(tài)復(fù)合物的形成常數(shù)。

從溫度影響、熒光壽命和吸收光譜等三方面判斷猝滅類型：(1)溫度影響:靜態(tài)猝滅時，分子復(fù)合物的穩(wěn)定性隨溫度的升高而下降，因而猝滅常數(shù)隨溫度的升高而減小；動態(tài)猝滅時，溫度升高，擴散系數(shù)增大，雙分子的猝滅常數(shù)增大，因而動態(tài)猝滅與溫度有關(guān)。(2)熒光壽命：靜態(tài)猝滅不因為猝滅劑的存在而影響熒光分子激發(fā)態(tài)的壽命，因而τ0/τ=1；動態(tài)猝滅因為猝滅劑的存在而使熒光壽命縮短，此時τ0/τ=F0/F。(3)吸收光譜：靜態(tài)猝滅因形成分子復(fù)合物而使吸收光譜發(fā)生變化；動態(tài)猝滅不改變熒光物質(zhì)的吸收光譜，只影響熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)。

本實驗采用Stern-Volmer方程進(jìn)行處理，以方便判斷猝滅類型，F(xiàn)0/F=1+KQτ0CQ=1+KsvCQ以F0/F對CQ作曲線圖(圖4)，數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

從圖4可以看出，F(xiàn)0/F對CQ呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，且曲線的斜率隨著溫度的升高而逐漸降低，可判斷兩種小分子二氫黃酮醇與BSA結(jié)合形成了復(fù)合物，應(yīng)為靜態(tài)猝滅過程。

文獻(xiàn)[16]報道，各類猝滅劑對生物大分子的碰撞猝滅常數(shù)約為2×1010L·mol-1·s-1，熒光壽命約為1×10-8s。從實驗結(jié)果看，兩種小分子二氫黃酮醇對BSA的猝滅常數(shù)都遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)，進(jìn)一步表明兩種二氫黃酮醇對BSA的猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

2.3結(jié)合常數(shù)的計算靜態(tài)猝滅過程中熒光強度F、猝滅劑濃度CQ和結(jié)合常數(shù)K之間的關(guān)系可用Line Weaver-Burk雙倒數(shù)函數(shù)表示：

(F0-F)-1=F0-1+K-1F0-1CQ-1

通過(F0-F)-1對CQ-1作曲線圖(圖5)，可求得二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA作用的結(jié)合常數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表2。

從表2可以看出，溫度對二氫槲皮素及二氫楊梅素與BSA的結(jié)合常數(shù)K的影響不大，K的數(shù)值均大于104，說明BSA與兩種二氫黃酮結(jié)合較強，而相同的溫度下二氫楊梅素的結(jié)合常數(shù)K較大，可能與二氫楊梅素的結(jié)構(gòu)B環(huán)上多一個羥基有關(guān)，進(jìn)而說明黃酮中的羥基參與了結(jié)合反應(yīng)。

2.4作用力類型的確定不同藥物小分子與大分子蛋白質(zhì)的作用力類型主要有氫鍵、范德華力、疏水作用力和靜電引力等。如溫度變化不大，反應(yīng)焓變ΔH可看成常數(shù)，作用力類型可以通過反應(yīng)前后熱力學(xué)參數(shù)焓變ΔH和熵變ΔS的大小進(jìn)行判斷。藥物小分子與大分子BSA之間作用的熱力學(xué)參數(shù)可表示為：

lnK2/K1=ΔH(1/T1-1/T2)/R

ΔS=-(ΔG-ΔH)/T

ΔG=ΔH-TΔS

通過選定T1=293 K，T2=303 K計算其熱力學(xué)參數(shù)，具體數(shù)據(jù)見表3。

表3 BSA與二氫槲皮素和二氫楊梅素結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)

從表3的熱力學(xué)數(shù)據(jù)來看，二氫槲皮素和二氫楊梅素的吉布斯自由能ΔG<0，說明兩種二氫黃酮與蛋白質(zhì)BSA的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的；ΔS>0，ΔH<0，說明兩者的結(jié)合力主要為疏水作用；二氫槲皮素和二氫楊梅素為多羥基類化合物，羥基將參與成鍵，因此除了疏水作用外，應(yīng)該還有氫鍵作用，兩種小分子物質(zhì)極有可能扦插到BSA中形成疏水空腔而使BSA的熒光發(fā)生猝滅。

3 結(jié)論

本實驗的研究表明，二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA之間存在相互作用并形成分子復(fù)合物，兩種小分子對BSA的熒光猝滅作用過程為靜態(tài)猝滅；根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)判斷，二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA作用主要是因為兩種小分子物質(zhì)扦插到BSA中后形成疏水空腔使其結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而出現(xiàn)熒光猝滅的靜態(tài)猝滅。

通過對二氫槲皮素和二氫楊梅素與BSA之間相互作用的研究，對于了解兩種小分子與BSA作用的機制，開發(fā)兩種小分子藥物及對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造有重要意義。