回醫烙灸療法對脊髓損傷大鼠Notch信號通路中Presenilin1、Hes1蛋白表達的影響

夏 鉑，范 靈

(寧夏醫科大學，銀川 750004）

脊髓損傷是一種臨床上比較嚴重的損傷性疾病，目前并沒有特別有效的治療手段，僅停留在對癥治療。回醫烙灸療法是一種治療脊髓損傷的新方法，在臨床上已經取得一定療效。本實驗取損傷脊髓組織，應用免疫組化法檢測大鼠脊髓組織中Notch信號通路中Presenilin1、Hes1蛋白表達，旨在從分子生物學角度探討回醫烙灸療法對不同介入時間大鼠脊髓損傷后神經修復功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗在寧夏醫科大學實驗動物中心完成，選取清潔級SD大鼠75只（寧夏醫科大學實驗動物中心提供，12周齡，體質量230～305 g，雄性）。

1.2 方法

1.2.1 分組 選取清潔級SD大鼠75只，隨機數字表法分為5組：A 組（假手術組）、 B 組（模型組）、C 組（西藥組）、D組（2 h烙灸組）、E組（6 h烙灸組），于第1、7、14、28 d每組各取3只損傷脊髓組織，共取60只，15只備用，免疫組化法檢測大鼠脊髓組織中Presenilin1、Hes1蛋白表達。A 組（假手術組），只做椎板切除，不做脊髓損傷；B 組（模型組），脊髓Allen’s打擊損傷后灌胃給予一定量生理鹽水，持續28 d；C 組（西藥組），脊髓Allen’s打擊損傷后0.5 h內首次按20 mg/kg醋酸潑尼松，隨后按 4.6 mg/（kg·h）給藥，3 h連續給藥，之后按7.2 mg/（kg·d），連續給藥7 d；D組（2 h烙灸組），脊髓Allen’s打擊損傷后2 h采用烙灸治療，烙灸隔日1次，1次5 min，持續28 d；E組（6 h烙灸組），脊髓Allen’s打擊損傷后6 h采用烙灸治療，烙灸隔日1次，持續28 d。各組于術后1 h經皮下注射4萬u/kg慶大霉素，1次/d，連續7 d。各組均給予一定量生理鹽水，持續28 d。

1.2.2 模型制備 改良的脊髓損傷Allen’s[1]造模。操作：大鼠麻醉、消毒，以T10為中心，沿脊柱方向切約3 cm的切口，切開皮膚、肌肉，分離并暴露棘突，將T10椎板全部切除，保留硬脊膜。采用自制的 Allen’s 改良式打擊裝置（將 15 g打擊棒套入鋼管內，卡住打擊高度，松開打擊棒即可下落） ，高度為5 cm，致傷量為75 g/cm，造成 T10～ T11節段急性脊髓損傷（此致傷量可造成大鼠的不完全性截癱，屬中等程度損傷）。動物出現擺尾反射，雙下肢及軀體回縮撲動后，見雙下肢不完全癱瘓，標志造模成功。

1.2.3 治療方法 固定大鼠，回醫特制烙灸器放在損傷大鼠兩側夾脊穴（在距損傷上下端兩個椎體的棘突間隙旁開距中線3～4 mm處取穴)。回醫特制烙灸器利用自制和脊柱形狀相似鐵質灸具制成，在灸槽內放有艾絨，點燃艾絨，利用鐵質灸具熱傳導，使局部發紅，排出異常體液。部位參照《實驗針灸學》（上海科學技術出版社）烙灸組于造模后2、6 h分別開始，隔日同一時間重復治療1次，每次灸5 min，持續28 d，并防止時間過長造成皮膚損傷。

1.2.4 標本采集 每組又按不同時間點分別在1、7、14、28 d各取3只，共取60只，15只備用，處死大鼠，取脊髓損傷部位上下1 cm的脊髓組織，制成免疫組化染色切片，進行免疫組化染色。

1.2.5 免疫組化染色 常規石蠟切片，脫蠟和水化，PBS洗5 min，滴加3%甲醇-H2O2溶液，濕盒室溫靜置15 min。PBS洗3次各5 min，抗原修復，微波爐中高火力4 min，低火20 min，自然降至室溫。PBS洗3次各5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫30～60 min，甩去多余液體，滴加I抗100 μL，4 ℃過夜，37 ℃復溫45 min。PBS洗3次各10 min，滴加Ⅱ抗100 μL，室溫靜置1 h。PBS洗3次各10 min，DAB顯色3 min，在顯微鏡下掌握染色程度。PBS洗 3次各5 min，蘇木精復染5 min，自來水洗15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3 圖像采集與統計學方法 每組選取6張圖像（400倍），釆用Image-Pro Plus Analysis Soft ware 6.0進行圖像分析，選取有效區域進行累積光密度值統計。實驗結果以均值±標準差（x± s ）表示。采用SPSS 16.0統計軟件進行數據處理和分析，2組間比較采用t檢驗，數據正態且方差齊時，釆用單因素方差分析LSD法進行比較，數據非正態和（或）方差不齊時，進行非參數檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠Presenilin1免疫組化染色統計結果 染色圖像Presenilin1免疫陽性信號表達呈現深褐色，主要出現在大鼠脊髓組織中的前角、中央管附近、后角部位。A組大鼠脊髓組織中有極少量陽性細胞顯色。B、C、D、E組可見不同程度的顏色改變，B組顯色最為明顯，D、E組顯色較輕。見圖1。

圖1 各組在術后14 d，免疫組化染色（200×）

統計結果：通過圖像分析系統對免疫組化圖像光密度的測算，第1、7、14、28 d，B、C、D、E組均大于A組，差異有統計學意義（P＜0.01）。損傷7、14 d，C、D、E組均小于B組，差異有統計學意義（P＜0.01），C、D、E組間差異無統計學意義；損傷28 d，D、E組小于B、C組，且D組表達率最顯著減弱，差異有統計學意義（P＜0.01）。見表1。2.2 各組大鼠Hes1免疫組化染色統計結果 染色圖像Hes1免疫陽性信號表達呈現棕黃色或棕灰色，主要出現在大鼠脊髓組織中的前角、中央管附近、后角部位。A組大鼠脊髓組織中有弱陽性表達。B組大鼠脊髓組織中受損局部Hes1呈強陽性表達，而且較A組顯著增強。B、C、D、E組可見黃色、深褐色不同程度的顯色，B組顯色最為明顯，D、E組顯色較輕。見圖2。

表1 各組大鼠Presenilin1蛋白表達的平均光密度比較（x± s ，n = 12）

圖2 各組在術后14 d，免疫組化染色（200×）

統計結果：通過圖像分析系統對免疫組化圖像光密度的測算，第1、7、14、28 d，B、C、D、E組均大于A組，差異有統計學意義（P＜0.01）。損傷7、14 d，C、D、E組均小于B組，差異有統計學意義（P＜0.01），C、D、E組間差異無統計學意義（P＞0.01）；損傷28 d，D、E組小于B、C組，且D組表達率最顯著減弱，差異有統計學意 義（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠Hes1蛋白表達的平均光密度比較（x± s ，n = 12）

3 討論

3.1 關于脊髓損傷大鼠Notch信號通路研究進展 脊髓損傷是由交通傷、墜落傷、跌倒傷、暴力或運動等因素引起的一種高致殘性中樞神經系統疾病，不僅會導致受損節段以下的感覺功能、運動功能、以及自主神經功能的障礙，而且會引起其他系統的功能障礙，進而影響到患者心理健康及正常社會交往[2-3]。它是一種常見的中樞神經系統損傷，能造成患者嚴重的神經功能損害，目前臨床上仍缺乏有效的方法來修復脊髓損傷[4-5]。脊髓損傷屬中醫瘀血所致“痿證”范疇，其致殘率和病死率極高[6]。全球每年有數以萬計的人遭受脊髓損傷的折磨，對病人產生毀滅性的打擊，有效的治療對于脊髓損傷患者來說不僅可以極大地提高生活質量，還可以減輕他們的心理及經濟負擔[7]。其中交通事故為脊髓損傷的首要原因，占 46. 9%。其次是工傷事故，占 33. 1%，其他損傷包括運動失誤、生活中的損傷、火器傷及銳器傷等[8-9]。 目前，醫學界雖然對脊髓損傷的發生機制還不十分清楚，但研究顯示，脊髓損傷的發生是一種多因素、多步驟的級聯瀑布效應機制[10-11]。現代醫學認為，繼發性損傷是導致急性脊髓損傷肢體功能障礙的主要原因之一[12]。由于中樞神經結構的特殊性，使脊髓損傷修復的研究經歷了漫長而曲折的過程，讓損傷的脊髓再生，因此成為許多神經科學家夢寐以求的目標[13]。 Notch信號通路是一條與細胞的生長、發育、凋亡密切相關的信號通路，在神經干細胞的增殖和分化過程中也有著至關重要的作用[14]。Ben-Shushan[15]等研究發現，抑制 Notch信號通路可以促進胚胎干細胞向運動神經元分化。在對神經元生長發育過程的研究中還發現，低水平的Notch信號還可以促進神經突的生長延伸，而上調Notch信號后則抑制神經突的延伸甚至導致神經突的回縮。Notch受體在S3切割位點水解的關鍵是γ-Secretase，是Notch信號通路的核心環節，而Presenilin1是γ-Secretase的活性中心，Presenilin1與其他幾種蛋白質結合成一個蛋白剪接復合體，負責Notch受體在S3切割位點的剪接[16]。Hes1是Notch信號通路的重要基因，Hes1高表達時可以促進神經干細胞的增殖，抑制神經干細胞分化為神經元，而當Hes1的表達減弱時，則可以促進神經干細胞向神經元細胞分化，因此，Hes1在神經干細胞的增殖和分化過程中發揮著重要的調節作用[17]。Grandbarbe[18]研究指出，Notch信號通路抑制神經干細胞向神經元細胞和少突膠質細胞的分化，而促進其向星形膠質細胞分化，而星形膠質細胞又可以通過Jagged1介導的Notch信號通路對神經再生發揮負調節作用[19]。Dias[20]等發現脊髓損傷后抑制Notch信號通路可以加強運動神經元的再生。

3.2 關于回醫烙灸療法 回醫烙灸療法是一種強刺激療法，它結合腧穴組織特點和經絡功能，利用藥物、器械加熱所產生的火熱刺激，通調氣血，直接或間接地激發人體內的潛能，通過皮膚和血管感受器的反射途徑傳到中樞神經系統，調節興奮和抑制過程。其通過擴張血管，調節循環，增強局部耐受性及機體抵抗力[21]。而脊髓損傷后期氣血不調，經絡堵塞造成肢體活動不利。治療正需要回醫烙灸強刺激手段，刺激周圍神經的敏感度，加強其與大腦中樞神經的聯系。它比“化膿灸”療法操作更加精準，且對皮膚的損傷程度較輕，對元氣的振奮與恢復更加迅速[22]。回醫在長期臨床使用中證實，烙灸療法對于經絡、筋經的不暢，骨與關節損傷性疾病有不可替代的獨特療效。該特色療法在長期的傳承和應用中，積累了豐富的臨床經驗，治療效果可靠，對醫療設備設施的依賴小，技術操作便于掌握，適合在基層推廣。

3.3 回醫烙灸療法對脊髓損傷大鼠Notch信號通路中Presenilin1、Hes1蛋白表達的影響 觀察不同時間點各組大鼠損傷局部Presenilin1、Hes1表達情況，正常組大鼠脊髓組織中的Presenilin1、Hes1表達均沒有變化，表明回醫烙灸療法對假手術組大鼠脊髓組織中Notch信號沒有影響，在脊髓損傷后的1、7、14 d，模型組大鼠損傷局部的Presenilin1、Hes1表達有顯著升高，表明脊髓損傷可以激活大鼠損傷局部Notch信號通路，這可能與脊髓損傷后神經組織的自我修復有關，并持續高表達至損傷后28 d，其持續的高表達可促進內源性神經干細胞的增殖，但是也抑制內源性神經干細胞的分化，這將不利于神經組織的修復，同時其高表達也促進星形膠質細胞的過度增生，過度增生的星形膠質細胞將會促進膠質瘢痕的形成，從而進一步阻礙神經功能的修復。而不同時間點西藥組、2 h烙灸組、6 h烙灸組大鼠脊髓組織中受損局部Presenilin1、Hes1的表達都較模型組顯著降低，烙灸組降低幅度最大，且2 h烙灸組最顯著。結果顯示，回醫烙灸療法通過抑制脊髓損傷大鼠局部Presenilin1、Hes1的表達，從而抑制Notch信號通路的表達，使Notch信號通路被抑制，不但促進內源性神經干細胞向神經元細胞和少突膠質細胞的分化，而且還抑制了內源性神經干細胞過度分化為星形膠質細胞，以促進其局部神經的修復，且前期烙灸干預的效果好于后期干預。