貞丹護肝方對小鼠實驗性肝炎的作用

史興清

(江西省景德鎮市第三人民醫院藥劑科，景德鎮 333000)

貞丹護肝方系本院中醫科治療肝炎的臨床經驗方，由女貞子、丹參、五味子、大黃、蒲公英、茵陳、黃芪、茯苓、甘草等藥物組成，具有解毒化瘀，滋陰養肝，益氣健脾的功效。該方臨床用于急慢性肝炎具有較好的療效。本研究旨在通過實驗驗證該方對小鼠實驗性肝炎的作用，為其進一步開發應用提供依據。

1 材料

1.1 動物 昆明種小鼠，體重（20±2）g，雌雄兼用。購自南昌大學醫學院實驗動物科學部。

1.2 受試藥物 貞丹護肝方由女貞子6g、丹參6g、五味子 3g、大黃 3g、蒲公英 6g、茵陳 6g、黃芪 6g、茯苓6g、甘草3g組成。以湯劑形式應用，方藥調配后煎湯取汁，濃縮成1g/ml（按生藥計）濃度的藥液，冰箱保存備用。臨用時以生理鹽水稀釋后灌胃給藥。給藥劑量以方藥總量45g/60kg為人用劑量，以該劑量乘以換算系數9后取整數6.0g/kg為小鼠中劑量組用量。取小鼠中劑量乘以1.5倍為高劑量組用量，乘以0.5倍為低劑量組用量。對照藥：聯苯雙酯滴丸，浙江萬邦藥業股份有限公司生產。

1.3 試劑 四氯化碳：天津市化學試劑一廠；D-氨基半乳糖：Sigma公司；卡介苗(BCG)，蘭州生物制品研究所；脂多糖(LPS)，Sigma公司；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒，南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 貞丹護肝方對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響 昆明種小鼠60只，體重（20±2）g，雌雄各半。小鼠適應性飼養1周后，隨機分成空白對照組、模型組、貞丹護肝方高、中、低劑量組、聯苯雙酯組，共6組。除空白對照組動物外，其余各組小鼠灌胃0.2%(v/v)四氯化碳橄欖油溶液，灌胃劑量為0.1ml/10g鼠體重。于造模后24h、48h、71h，貞丹護肝方高、中、低劑量組分別給予貞丹護肝方煎劑9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，聯苯雙酯組給予聯苯雙酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水，共3次。第72h后，全部動物眼眶取血，4000r/min離心10min，分離血清，測定ALT。

2.2 貞丹護肝方對D-氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的保護作用 取昆明種小鼠60只，體重（20±2）g，雌雄各半。分組同2.1。貞丹護肝方高、中、低劑量組分別給予貞丹護肝方煎劑9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，聯苯雙酯組給予聯苯雙酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白對照組和模型組灌胃等體積生理鹽水。每天1次，共7d。末次給藥后1h，除空白對照組外，其他各組小鼠腹腔注射D-氨基半乳糖8mg/10g體重，24h后眼球取血，常規分離血清，測定ALT含量。

2．3貞丹護肝方對小鼠免疫性肝損傷的影響 取昆明種小鼠 60只，體重（20±2）g，雌雄各半。 分組同2．1。除空白對照組外其他各組小鼠尾靜脈給小鼠尾靜脈注射(iv)卡介苗（BCG）漿液 0.2ml/只(含5×106個菌)，致敏后10d，再尾靜脈注射脂多糖（LPS）(7.5μg/只)，造成免疫性肝炎模型。 從小鼠尾靜脈注射BCG的當天開始，貞丹護肝方高、中、低劑量組分別給予貞丹護肝方煎劑9.0g/kg、6.0g/kg、3.0g/kg灌胃，聯苯雙酯組給予聯苯雙酯滴丸4.5mg/kg灌胃，空白對照組和模型組小鼠灌胃等容量的生理鹽水，每天1次，連續7d。在尾靜脈注射LPS 10h后眼球取血，常規分離血清，測定ALT含量。取血后處死小鼠，取肝左葉固定，常規石蠟切片，HE染色，普通光鏡觀察組織病理學情況。

2.4 統計方法 實驗數據用SPSS 11.5統計軟件分析，數據結果均以平均值±標準差（x±s）表示，方差分析，q檢驗。

3 結果

3.1 貞丹護肝方對四氯化碳致小鼠急性肝損傷的影響 實驗結果，見表1。表1顯示，與模型組比較，貞丹護肝方各劑量組對CCl4造成的急性肝損傷小鼠ALT升高有顯著的降低作用(P<0.01)。

3.2 貞丹護肝方對D一氨基半乳糖致小鼠急性肝損傷的影響 實驗結果，見表2。表2顯示，與模型組比較，貞丹護肝方各劑量組對D-氨基半乳糖造成的肝損傷小鼠ALT活性升高有顯著的降低作用(P<0.01)。

3.3 貞丹護肝方對小鼠免疫性肝損傷的影響 實驗結果，見表3。表3顯示，與模型組比較，貞丹護肝方各劑量組對免疫性肝損傷小鼠ALT活性升高有顯著的降低作用(P<0.01)。其中貞丹護肝方中劑量組與聯苯雙酯組比較也有顯著性差異(P<0.05)。

表2 貞丹護肝方對D-氨基半乳糖致急性肝損傷小鼠血清ALT含量的影響(x±s，n=10)

表3 貞丹護肝方對免疫性肝損傷小鼠血清ALT含量的影響(x±s，n=10)

3．4貞丹護肝方對免疫性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響 光鏡下觀察可見模型組小鼠肝細胞呈脂肪變性，伴有點狀壞死，肝組織結構紊亂，有明顯炎細胞浸潤；貞丹護肝方高、低劑量組和聯苯雙酯組可見炎細胞浸潤，但病理程度較模型組明顯減輕；貞丹護肝方中劑量組僅見少數炎細胞浸潤，其病理程度最輕。

4 討論

貞丹護肝方由女貞子、丹參、五味子、大黃、蒲公英、茵陳、黃芪、茯苓、甘草等藥物組成。方中女貞子滋養肝陰，富含保肝降酶的齊墩果酸；丹參活血化瘀改善肝臟血流，且有抗肝纖維化作用；五味子為保肝降酶要藥；大黃、蒲公英、茵陳清熱利濕解毒；黃芪、茯苓益氣健脾，扶助正氣以增強機體免疫力，諸藥合用用，臨床用于治療肝炎具有良好效果。

本實驗采用四氯化碳肝損傷、D-氨基半乳糖肝損傷和免疫性肝損傷3種肝炎模型進行試驗，結果顯示貞丹護肝方對上述3種實驗性肝炎均有明顯效果。

四氯化碳引起肝損傷模型是肝損傷的經典模型。其特點是能準確反映肝細胞的功能、代謝及形態學變化，重復性好[1，2]。D-氨基半乳糖是肝細胞的磷酸尿嘧啶核苷的干擾劑，可造成肝臟彌漫性變性、壞死和炎癥反應，與臨床上急性普通型肝炎的病理變化接近[3，4]，免疫性肝損傷動物模型接近人類病毒性肝炎肝炎發生的病理生理過程，病毒性肝炎引起的肝損傷主要由機體免疫應答反應所介導，當病毒激活機體免疫系統后，產生病毒特異性細胞毒性T細胞。它們不但能與體內病毒起反應而加以殺滅，也會損傷表面帶有病毒抗原的肝細胞，導致肝細胞變性腫脹和壞死[5，6]。

ALT是存在于肝細胞漿內的可溶性酶，當肝細胞因各種因素而出現損傷時，細胞膜結構破壞，通透性改變，即可從細胞內逸出細胞外而進人血循環中。此時血清ALT較正常增高，故血清ALT測定是反映肝損傷的靈敏指標[7]。血清ALT水平高低可以反映肝細胞損傷程度。本實驗結果顯示貞丹護肝方對上述三種實驗性肝損傷模型小鼠的ALT升高均有明顯的降低作用，表明貞丹護肝方具有明顯的抗肝傷作用。本方劑組方用藥量偏輕，因其組方思路遵循藥皆有“毒”，護肝之劑用量宜輕不宜重的理念。本實驗觀察到中劑量的貞丹護肝方對于與人類病毒性肝炎肝炎病理變化接近的免疫性肝損傷模型小鼠的ALT升高的降低作用和病理減輕程度有優于對照藥物的表現，表明其組方思路有其合理性。本實驗顯示貞丹護肝方這一中藥方劑在治療肝炎上有其自身優勢，值得進一步深入研究。