不同品種烤煙根際微生物群落結構及多樣性研究

李 強，孫敬釗，皮本陽，黃文華，孔午圓，陳 蘇，賀 非

(常德市煙草公司臨澧縣分公司，湖南常德 415000)

土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在土壤的形成發育、物質循環、肥力演變以及植物生長等方面有極其重要的作用[1-2]。近年來，隨著土地復種指數的提高，以及長期過量施用化肥和農藥，導致土壤生態環境不斷惡化，土壤板結、微生物種群結構趨劣、煙草病蟲害發病率不斷上升、煙葉品質下降等問題愈發嚴重[3-6]。因此，在農業生產中探究土壤微生物多樣性變化以及微生物群落結構特征，對保障作物高產穩產、推動煙葉生產可持續發展具有重要意義。

云煙99、云煙87、云煙97和K326是湖南省濃香型特色烤煙主栽品種，前人對其產量、煙葉品質、生長發育等方面研究較多[7-10]，但不同烤煙品種根際微生態環境之間有何差異，目前鮮見報道。因此，筆者通過小區試驗，研究不同品種烤煙根際微生物群落結構及多樣性差異，以期為改善烤煙根際土壤微生態提供理論依據。

1 材料與方法

1.1試驗地概況于2015、2016年在湖南省常德市臨澧縣進行試驗，土壤類型為黏壤土。0～20 cm耕作層土壤pH 5.9，有機質16.8 g/kg，堿解氮114.19 mg/kg，速效磷18.42 mg/kg，速效鉀134.46 mg/kg。

1.2試驗設計試驗共設4個品種處理：云煙99(Y99)、云煙87(Y87)、云煙97(Y97)、K326，每個處理3次重復。采用隨機區組設計，各小區面積30 m2，每小區種50株烤煙，行距120 cm，株距50 cm。區組設通道，四周設保護行。

1.3取樣及分析方法各品種烤煙于2015年4月10日、2016年4月12日移栽，在烤煙旺長期，即2015年6月11日、2016年6月13日采集根際土壤。按小區5點取樣法選取5株烤煙，采用抖土法，先輕輕抖落大塊不含根系的非根際土壤，然后輕輕剝離根系表面附著的土壤，獲取根際土壤后，用4分法取適量于無菌袋中立即帶回實驗室。采用Biolog-Eco微平板方法[11]測定土壤微生物代謝功能多樣性。

1.4指標計算方法采用平均顏色變化率(average well color development，AWCD)描述土壤微生物群落的代謝活性；采用Shannon多樣性指數(H)、Mcintosh均一性指數(U)、Simpson優勢度指數(D)表征土壤微生物群落多樣性。各指標計算公式[12-13]：

AWCD=∑(Ci-R)/n，式中，Ci、R分別為反應孔、對照孔在590 nm下的吸光度，n為培養基碳源種類數。

H= -∑(Pi×lnPi)，式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比值。

D=1-∑(Pi×Pi)，式中，Pi為第i孔的相對吸光值與整個平板相對吸光值總和的比值。

碳源利用率為整個培養過程中該類碳源相對吸光值之和與整個平板相對吸光值總和的比率。

1.5數據分析試驗數據采用Excel 2007進行處理；采用SPSS 17.0軟件進行方差分析、主成分分析，差異顯著性分析采用Duncan新復極差方法，顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1不同品種烤煙根際微生物群落代謝活性AWCD是評價微生物對碳源利用能力的一個重要指標，反映了土壤微生物的代謝活性，AWCD值越大，代謝活性越高[14]。由圖1可知，隨著培養時間的延長，各品種根際微生物AWCD值呈先不斷增加后趨于穩定的趨勢。在培養起始的24 h內，各處理AWCD值均較低，說明此時根際微生物群落代謝活性較低，碳源基本未利用；在24 h后，AWCD值急速上升，表明微生物代謝活躍，碳源開始被大量利用；2015年根際微生物AWCD值在168 h趨于平緩，2016年根際微生物AWCD值在144 h趨于平緩，說明此時微生物活性達到穩定。總體上，AWCD值整體表現為K326>Y97>Y87>Y99，說明K326根際微生物群落代謝活性最高，云煙99(Y99)根際微生物群落代謝活性最低。

圖1 根際微生物AWCD的動態變化Fig.1 AWCD dynamics of rhizospheric microorganisms

2.2不同品種烤煙根際微生物碳源利用偏好土壤微生物活性反映了群落總體的變化，但未反映微生物群落代謝詳細信息，研究土壤微生物對碳源的利用偏好，有助于更加全面地了解微生物群落代謝功能特性。根據微生物對營養物質代謝途徑的不同，將Biolog-ECO微孔板上31種底物碳源分為6類：碳水化合物、羧酸類、氨基酸類、胺類、聚合物、酚酸類；利用AWCD值分別計算出2015和2016年不同碳源的利用率，然后得出2年試驗的平均利用率，用以表征根際微生物對碳源的利用偏好。

由圖2可知，Y99、Y87、Y97、K326根際微生物對6類碳源的利用情況有一定差異，碳源利用率總體以碳水化合物、羧酸類、氨基酸類較高。其中Y99根際微生物對羧酸類碳源利用最多，平均利用率為22.1%，對酚酸類利用最少，平均利用率僅為8.3%。Y87、Y97、K326根際微生物利用最多的均是碳水化合物，平均利用率分別為21.4%、20.3%、19.7%，利用最少的均是酚酸類，平均利用率分別為9.7%、9.5%、13.1%。由此可知，Y99根際微生物偏好羧酸類碳源，而Y87、Y97、K326根際微生物偏好碳水化合物碳源。

圖2 不同品種烤煙根際微生物對碳源利用率Fig.2 Carbon source utilization rate by rhizospheric microorganisms of different varieties of flue-cured tobacco

2.3不同品種烤煙根際微生物碳源利用的主成分分析為了進一步探討4個不同品種烤煙，其根際微生物碳源利用方式的差異，將根際微生物120 h測定的AWCD值進行主成分分析，并根據微生物對各類碳源利用的因子權重值，分析不同品種烤煙根際微生物群落多樣性的變化。在2015和2016年的試驗中，均提取了5個主成分，累計貢獻率分別達94.1%、95.8%，第1主成分(PC1)貢獻率分別為59.5%、64.1%，第2主成分(PC2)貢獻率分別為12.3%、12.4%。因第3～5個主成分貢獻率較小，因此取前2個主成分進行重點分析。

選取PC1和PC2的得分做圖來表征微生物群落碳源代謝特征。由圖3可知，2015和2016年試驗結果均顯示，Y87、Y97、K326在PC1的得分均為正值，根際微生物群落碳源利用特征相似，而Y99得分值為負值，表明PC1的碳源是區分Y99與其他3個品種間差異的敏感碳源；Y99、Y87、K326在PC2的得分均為正值，根際微生物群落碳源利用特征相似，而Y97得分值為負值，表明PC2的碳源是區分Y97與其他3個品種間差異的敏感碳源。

碳源載荷值反映了碳源利用與主因子的相關性，載荷值越高，表示其對主成分的影響越大[15]。由表1可知，2015年試驗中，與PC1相關性較高(載荷值>0.6)的碳源有26種，其中碳水化合物9種，羧酸類7種，氨基酸類5種，聚合物和胺類均為2種，酚酸類1種；與PC2相關性較高的碳源有3種：β-甲基D-葡萄糖、D-半乳糖醛酸、L-苯基丙氨酸，分別屬于碳水化合物、羧酸類、氨基酸類。由圖3可知，碳水化合物、羧酸、氨基酸是區分云煙99(Y99)與其他3個品種間差異的敏感碳源。

2016年試驗中，與PC1相關性較高的碳源有28種，其中碳水化合物9種，羧酸類7種，氨基酸類6種，聚合物、酚酸類、胺類均為2種；與PC2相關性較高的碳源有2種：a-丁酮酸、肝糖，分別屬于羧酸類、聚合物。碳水化合物、羧酸、氨基酸是區分Y99與其他3個品種間差異的敏感碳源，這與2015年試驗結果一致。

圖3 主成分分析Fig.3 Principal component analysis

碳源類型Carbon source type底物Substrates2015年PC1PC22016年PC1PC2碳水化合物D-甘露醇D-Mannitol0.966 0.844 Carbonhydratesa-D-乳糖a-D-Lactose0.925 0.710 丙酮酸甲脂Pyruvic Acid Methyl Ester0.840 0.942 I-赤藻糖醇I-Erythritol0.802 0.875 D-纖維二糖D-Cellobiose0.754 0.855 葡萄糖-1-磷酸鹽Glucose-1-Phosphate0.753 0.699 D-木糖D-Xylose0.736 0.623 β-甲基D-葡萄糖β-Methyl-D-Glucoside0.726 0.601 0.661 N-乙酰基-D-葡萄胺N-Acetyl-D-Glucosamine0.634 0.863 羧酸類a-丁酮酸a-Ketobutyric Acid0.865 0.746 0.603Carboxylic acidsD-葡萄胺酸D-Glucosaminic Acid0.860 0.929 D-蘋果酸D-Malic Acid0.843 0.846 衣康酸Itaconic Acid0.801 0.823 D-半乳糖內酯D-Galactonic Acid y-Lactone0.760 0.768 y-羥基丁酸y-Hydroxybutyric Acid0.675 0.601 D-半乳糖醛酸D-Galacturonic Acid0.613 0.614 0.817 D,L-a-甘油D,L-a-Glycerol氨基酸類L-天冬酰胺酸L-Asparagine0.920 0.959 Amino acidsL-絲氨酸L-Serine0.859 0.959 L-精氨酸L-Arginine0.854 0.815 L-蘇氨酸L-Threonine0.809 0.847 甘氨酰-L-谷氨酸Glycyl-L-Glutamic Acid0.800 0.898 L-苯基丙氨酸L-Phenylalanine0.790 0.815 聚合物吐溫80 Tween 800.911 0.905 Polymers吐溫40 Tween 400.910 0.954 肝糖Glycogen0.676a-環式糊精a-Cyclodextrin0.637 酚酸類4-羥基苯甲酸4-Hydroxy Benzoic Acid0.887 0.919 Phenolic acids2-羥基苯甲酸2-Hydroxy Benzoic Acid胺類苯乙基胺Phenylethyl-amine0.814 0.863 Amines腐胺Putrescine0.634 0.727

2.4不同品種烤煙根際微生物群落功能多樣性指數不同多樣性指數可以從不同方面來描述微生物群落的多樣性，多樣性指數越大，微生物群落功能多樣性越高[16]。其中Shannon多樣性指數用來表征生態系統中的物種及其個體數；Simpson優勢度指數反映群落中優勢種群的數量；Mcintosh均一性指數用來描述群落中個體分布的均勻情況[17-18]。

由表2可知，不同品種烤煙，根際微生物群落多樣性指數存在一定差別。各處理Shannon指數、Simpson指數在2年的試驗中均無顯著變化，可見不同品種烤煙之間根際微生物種類和優勢種群數量無顯著差異。Mcintosh指數在2年試驗中均表現為K326>Y97>Y87>Y99的規律，且各處理間存在顯著差異；其中K326的根際微生物Mcintosh指數最大，平均為7.652，Y99最小，平均為5.588，前者是后者的1.37倍。綜合而言，不同品種的烤煙，其根際微生物種類和優勢種群數量并無差異，但微生物種群的分布情況存在顯著差異，尤以K326根際微生物群落物種分布最均勻。

表2根際微生物群落多樣性指數

Table2Diversityindicesofrhizosphericmicroorganismscommunities

年份Test year品種CulticarShannon 指數 Shannon index(H)Mcintosh 指數 Mcintosh index(U)Simpson 指數Simpson index(D)2015Y993.119 a5.704 d0.949 aY873.134 a6.391 c0.954 aY973.274 a7.221 b0.959 aK3263.244 a7.661 a0.957 a2016Y993.158 a5.472 d0.952 aY873.253 a6.312 c0.957 aY973.273 a7.130 b0.959 aK3263.169 a7.643 a0.954 a

注：同列不同小寫字母表示不同品種間差異顯著(P<0.05)

Note:Different lowercases in the same column stand for significant differences between different varieties at 0.05 level

3 結論與討論

微生物對碳源利用能力可以反映微生物群落代謝活性水平。王戈等[19]通過研究云85、K326、凈葉黃、紅花大金元4種烤煙根際微生物數量及多樣性的差異，發現不同品種烤煙根際微生物對碳源總體利用能力存在一定差異，其中云85根際微生物群落代謝活性最高。該研究結果表明，根際微生物群落代謝活性表現為K326>Y97>Y87>Y99，K326根際微生物群落代謝活性最高，云煙99根際微生物群落代謝活性最低。

根際土壤微生物對碳水化合物、羧酸類、氨基酸類、胺類、聚合物和酚酸類6類碳源的利用率在一定程度上反映微生物的群落結構。蔡秋華等[20]研究發現，在尋甸試驗點，不同品種對碳源的利用率表現為K326>云煙87>紅花大金元；在石林試驗點，利用率則表現為紅花大金元>K326>云煙87。該研究結果表明，云煙99根際微生物對羧酸類碳源利用最多，而云煙87、云煙97、K326根際微生物對碳水化合物碳源利用最多。

主成分分析結果表明，云煙87、云煙97、K326得分值集中分布在PC1正半軸，而云煙99則位于PC1負半軸；碳水化合物、羧酸類、氨基酸類這3類碳源在PC1上相關性較高，綜合分析認為，云煙87、云煙97、K326偏好碳水化合物、羧酸類、氨基酸類物質。

許玲[21]通過分析12個不同品種烤煙節肢動物群落結構的差異，發現豫煙6號的多樣性、均勻度、優勢集中性都較高，Y8324各群落特征指數較低。該研究結果表明，不同品種的烤煙，其根際微生物種類(Shannon指數)和優勢種群數量(Simpson指數)并無差異，Mcintosh指數在2年的試驗中均表現為K326>Y97>Y87>Y99的規律，表明K326根際微生物群落物種分布最均勻。