汞離子功能核酸生物傳感器的建立與應(yīng)用

杜再慧 李相陽 田晶晶 田洪濤 許文濤

摘 要 利用汞離子（Hg2+）特異性功能核酸對Hg2+識別檢測，其中模板主要包括與Hg2+特異性結(jié)合的識別區(qū)、形成G四鏈體的富G區(qū)以及由聚六乙二醇（Spacer18）鏈接的隔斷區(qū)； 靶序列主要包括5'端配對區(qū)和3'端富T區(qū)。模板與靶序列只有在Hg2+存在的條件下才能結(jié)合并引發(fā)延伸，進而使富G序列在模板上剝離下來，但由于Spacer18的隔斷作用導(dǎo)致富G序列以單鏈形式存在，在特定環(huán)境下形成具有過氧化物模擬酶活性的G-四鏈體，催化H2O2與2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）發(fā)生肉眼可見的顏色變化，進而對Hg2+進行定量測定。利用構(gòu)建的Hg2+功能核酸生物傳感器，35 min內(nèi)可完成檢測，線性范圍為20～500 nmol/L， 檢出限達到16.5 nmol/L （3σ）。 實際水樣中的加標回收率為98.5%～103.5%。本方法操作簡單、成本低、耗時短，在應(yīng)急處理、實時環(huán)境檢測等方面具有良好的應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞 汞離子； G四鏈體； 間隔臂； 功能核酸； 生物傳感器

1 引 言

汞 （Hg）是一種分布廣泛的重金屬，進入環(huán)境后很難降解，可通過生物富集作用在動物或人體內(nèi)積累，對人體健康具有極大的危害[1～3]。生活飲用水衛(wèi)生標準GB 5749-2006中規(guī)定Hg2+限量值為 1 mg/L[4]。建立一種廉價、快速、靈敏、特異性的Hg2+的檢測方法是非常必要的。傳統(tǒng)的Hg2+檢測方法主要包括原子吸收光譜法（AAS）[5]、原子熒光光譜法（AFS）[6]等，方法靈敏、檢出限低，但一般需要大型儀器和專業(yè)的操作人員，檢測周期長，費用高。近年來，研究者不斷開發(fā)出特異性金屬離子功能核酸， 具有易于修飾、成本低、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、特異性強等優(yōu)點[7，8]，使得Hg2+功能核酸生物傳感器發(fā)展迅速[9]。

Hg2+能與富有胸腺嘧啶（T）的脫氧核苷酸鏈特異性結(jié)合形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)[10]，其結(jié)合強度超過正常的腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）配對。因此T-Hg2+-T錯配可以作為一種良好的Hg2+識別元件。基于T-Hg2+-T錯配可引起寡核苷酸鏈結(jié)構(gòu)的變化、替換以及重組的原理建立的分析方法被廣泛用于Hg2+的檢測。近年來，在Hg2+與胸腺嘧啶相互作用的基礎(chǔ)上，研究者采用電化學(xué)[11～13]、熒光[14，15]或者比色[16～18]作為信號輸出方式， 建立了許多Hg2+檢測方法。 其中，比色傳感器具有無需分析儀器、肉眼可讀、快速、容易操作等優(yōu)點[19]，是Hg2+定點診斷、原位快速篩選的理想方法。最常見的比色傳感器是通過氯高鐵血紅素（Hemin）和富G序列形成的具有過氧化物模擬酶（HRP）活性的G四鏈體，可以在H2O2存在的條件下催化2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二胺鹽（ABTS2-）發(fā)生顏色變化。

本研究以帶有富G和隔斷的序列為模板對Hg2+進行特異性檢測，靶序列與模板序列同時含有6個連續(xù)T堿基的序列，不存在Hg2+時，兩條序列不能結(jié)合，因此不發(fā)生延伸。當(dāng)溶液中含有Hg2+時，靶序列與模板間通過T-Hg-T堿基錯配形成穩(wěn)定的雙鏈結(jié)構(gòu)， 在DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）和脫氧核糖核苷酸（dNTPs）存在的條件下發(fā)生延伸，但由于隔斷序列的存在，富G序列只能從模板上剝離下來，以游離的單鏈形式存在。在K+、Hemin存在的條件下，形成具有過氧化物模擬酶活性的G四鏈體； 在H2O2存在的條件下，催化ABTS發(fā)生肉眼可見的顏色變化，通過顏色的變化可以對Hg2+進行定量檢測。

4 結(jié) 論

利用Hg2+和胸腺嘧啶特異性結(jié)合形成T-Hg-T堿基錯配，進而引發(fā)延伸反應(yīng)，發(fā)生鏈置換，釋放出單鏈富G序列，在K+和Hemin存在下形成具有過氧化物模擬酶活性的G-四鏈體，催化H2O2與ABTS發(fā)生肉眼可見的顏色變化，進而實現(xiàn)對Hg2+的定量檢測，建立了一種Hg2+比色傳感器。此傳感器設(shè)計簡單、操作方便、檢測時間短，結(jié)果肉眼可見，具有良好的靈敏度和選擇性。檢出限達到16.5 nmol/L（3σ），可以滿足自來水樣品中Hg2+的檢測要求。

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Abstract Excessive mercury ions have negative effects on individual health. So， it is of great significance to develop a method for rapid， sensitive and specific detection of Hg2+. In this study， the method for detection of Hg2+ was developed based on specific T-Hg-T mismatche and G-quadruplex. The template sequence mainly included the recognition region which could combine with Hg2+ specifically， the rich G region which could form G-quadruplex， and the speacer 18 partition zone. The target sequence mainly included 5' ends combining area and 3' end T-rich region. Templates and targets could be combined and the elongation was triggered only in the presence of Hg2+. Furthermore， the G-rich sequences were stripped off the templates and could form a single-stranded structure， because Spacer 18 had partition function. The G-quadruplex was formed with the K+ and hemin， and catalyzed H2O2-2，2-azinobis （3-ethylbenzothiozoline）-6-sulfonic acid（ABTS） reaction with color variations. The detection could be done within 35 min， and the Hg2+ concentration exhibited a linear correlation with absorbance at 414 nm within range of 20-500 nmol/L， with a detection limit of 16.5 nmol/L （3σ）. The recoveries of Hg2+ spiked in tap water were 98.5%-103.5%. The method exhibited the advantages such as simple operation， low cost and short time， and operation value in emergency treatment and real-time environmental detection.

Keywords Mercury ion ； G-quadruplex； Spacer arm； Functional nucleic acid； Biosensor

（Received 5 November 2017； accepted 8 March 2018）