響應面試驗優化木瓜蛋白酶法脫馬齒莧多糖蛋白工藝

胡慶娟，吳光杰，牛慶川，白書瑜，賀文杰，宋 皓，李玉萍*

（江西科技師范大學生命科學學院，江西 南昌 330013）

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）為藥食兩用的一年生草本植物，具有保護神經[1-2]、抗菌[3]、抗糖尿病[4-5]、抗氧化[6]、抗炎[7]、抗癌[8-10]等多種功效。研究表明馬齒莧中含有生物堿、黃酮、多糖、多巴胺等多種生物活性成分[11-15]。其中，馬齒莧多糖（polysaccharide from Portulaca oleracea L.，POP）是其主要活性成分之一，具有提高免疫力、抗病毒、降糖調脂、抗癌及抗衰老等生物活性[6,10,16-23]。

在提取POP的過程中，一般采用傳統的Sevag法、三氯乙酸法和鹽酸法脫除馬齒莧多糖蛋白[24-25]，尚鮮見木瓜蛋白酶法脫除馬齒莧多糖蛋白的報道。以上幾種脫除馬齒莧多糖蛋白的方法需使用大量有機溶劑、步驟復雜、耗費大量時間，且存在大量多糖損失等問題[24-25]。酶促反應溫和，可以水解較少的與多糖結合牢固的蛋白或被多糖包裹的蛋白，將糖釋放出來，提升多糖得率。已有實驗研究表明，相比于胰蛋白酶和中性蛋白酶，木瓜蛋白酶的脫蛋白效果更好[26]。響應面法能以最簡單、高效的方式充分考慮各試驗因素的交互作用，被廣泛應用于分離提取的工藝優化和過程控制。

為此，本實驗以POP損失率與POP溶液中蛋白去除率作為考察指標，探討木瓜蛋白酶法脫除馬齒莧多糖蛋白的效果，同時采用響應面法優化脫蛋白工藝，確定其最佳脫蛋白工藝；并對所獲取的POP進行分離純化以及高效液相色譜鑒定，確定POP所含的單糖種類，旨在為研究POP的進一步研究與開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬齒莧購于江西省南昌市某蔬菜批發市場，經江西科技師范大學藥學院藥理學教研室鑒定，洗凈烘干粉碎后備用。

牛血清白蛋白 杭州四季青生物工程材料有限公司；木瓜蛋白酶（≥3 U/mg）、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA） 美國Aladdin公司；考馬斯亮藍G-250 碧云天生物技術有限公司；葡萄糖、DEAE-52纖維素、Sephadex G-200 北京Solarbio公司；葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸 美國Sigma公司；葡聚糖中國計量科學院；所用化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

D-63505鼓風干燥箱 美國Thermo公司；FW-177粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；HH5電熱恒溫水浴鍋上海博訊實業有限公司；UV-2600型紫外-可見分光光度計美國Unico公司；JJ500精密電子天平 美國雙杰兄弟公司；Milli-Q超純水系統 美國Millipore公司；PHS-29A數顯酸度計 上海虹益儀器有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司；BSZ-100B型自動部分收集器、DHL-A型電腦恒流泵 上海瀘西分析儀器廠；真空冷凍干燥機 德國Labxonco公司；旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；5804R型離心機 德國Eppendorf公司；F-2700熒光分光光度計 日本Corporation公司。

1.3 方法

1.3.1 POP的制備

將馬齒莧粉末進行分組包裝（20 g/個）放置在索氏提取器內，加入150 mL的石油醚，90 ℃回流2 h，溶劑揮干后，重新置于索氏提取器中，加80%乙醇溶液150 mL于圓底燒瓶中，90 ℃回流2 h，將處理好的馬齒莧粉末在通風處揮干備用。按照水料比15∶1（mL/g）、提取溫度90 ℃，提取時間分別按照90、60、30 min提取3 次，4 層濾布過濾，收集濾液，合并3 次濾液，4 000 r/min離心10 min[27]，收集所有上清液。將所得上清液減壓濃縮，然后用80%乙醇溶液醇沉[27]，4 ℃過夜。離心，分別用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌沉淀，之后用適量水溶解。以大孔樹脂用量60 g/L加入AB-8樹脂、脫色時間3.5 h、脫色溫度50 ℃進行脫色[28]，過濾離心，80%乙醇溶液醇沉，4 ℃過夜，離心之后用適量水溶解沉淀，冷凍干燥，得到粗提POP。

1.3.2 標準曲線的制備

蛋白標準曲線建立：采用考馬斯亮藍G-250法[24]檢測蛋白質含量。配制考馬斯亮藍G-250染液。配制1 mg/mL的牛血清蛋白標準液，分別移取0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL標準液于具塞試管內，用蒸餾水補到1 mL，逐管加入5 mL考馬斯亮藍G-250染液，立刻渦旋混合，放置2 min后，在595 nm波長處測定吸光度。以牛血清白蛋白的質量濃度為X軸，吸光度為Y軸，作回歸曲線，得回歸方程：Y=0.825 7X+0.016 3，R2=0.998 4。

葡萄糖標準曲線建立：采用蒽酮-硫酸法[29]檢測多糖含量。配制質量濃度為1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，將標準溶液稀釋成0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的系列葡萄糖標準液，分別精確移取1.0 mL系列葡萄糖標準液于具塞試管內，用1.0 mL蒸餾水當作空白對照，逐管加入4.0 mL蒽酮-硫酸試液（0.3 mg/mL，現配）。迅速搖勻，將全部試管一起放在沸水浴中加熱7 min，最后用流動的水冷卻到室溫。放置10 min之后，在580 nm波長測定吸光度。以葡萄糖系列標準溶液的質量濃度為X軸，吸光度為Y軸，作回歸曲線，得回歸方程Y=9.638 6X+0.017 6，R2=0.997。

1.3.3 POP損失率及蛋白去除率的測定

采用考馬斯亮藍G-250法，按照公式（1）計算蛋白去除率：

式中：A0表示脫蛋白前樣品中蛋白含量；A1表示脫蛋白后樣品中蛋白含量。

采用蒽酮-硫酸法，按照公式（2）計算多糖損失率：

式中：B0表示脫蛋白前樣品中多糖含量；B1表示脫蛋白后樣品中多糖含量。

1.3.4 單因素試驗

在酶解時間3 h、酶解溫度60 ℃、pH 6.0的條件下，分別以0.05∶1、0.1∶1、0.15∶1、0.2∶1、0.25∶1、0.3∶1的酶液-樣液體積比（酶液1 000 U/mL，樣液10 mg/mL），進行酶法脫蛋白，之后在沸水浴中加熱滅活10 min，4 000 r/min離心10 min，除去蛋白取上清液，用80%乙醇溶液醇沉4 ℃過夜，除去乙醇將多糖復溶，測得其多糖及蛋白質量濃度，根據1.3.3節的公式得出POP損失率及POP中蛋白去除率，考察酶液-樣液體積比對木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

在酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解溫度60 ℃、pH 6.0的條件下，分別酶解1、1.5、2、2.5、3、3.5 h，考察酶解時間對木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

以酶液-樣液體積比0.2∶1、pH 6，分別在40、50、60、70、80 ℃溫度條件下酶解3 h，考察酶解溫度對木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

以酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解溫度60 ℃，分別在pH 3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.5條件下酶解3 h，考察pH值對木瓜蛋白酶法脫蛋白的影響。

1.3.5 響應面試驗

在上述單因素試驗基礎上，選取酶液-樣液體積比（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）為自變量，以POP中蛋白去除率與多糖損失率的比值為響應值（Y），應用Box-Behnken試驗原理，采用4因素3水平響應面分析法進行試驗設計，優化POP木瓜蛋白酶法脫蛋白工藝。響應面試驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平設計Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of the optimization parameters used in Box-Behnken experimental design

1.3.6 POP的分離純化

稱取350 mg粗提POP溶于蒸餾水中，終質量濃度為1 mg/mL，上樣至纖維素DEAE-52陰離子交換層析柱（2.8 cm×60 cm）中，隨后用0.1～0.4 mol/L NaCl溶液（流速1 mL/min，溫度20～25 ℃）梯度洗脫，用數控計滴自動部分收集器收集洗脫液，每10 min收集一管（10 mL/管），并用蒽酮-硫酸法逐管檢測多糖含量，收集主峰部分，得到2 個主要組分，依次命名為POP-A和POP-B。然后將收集液上Sephadex G-200凝膠柱（1.5 cm×60 cm）進一步純化，0.05 mol/L NaCl溶液（流速0.5 mL/min）洗脫，每隔4 min收集一次（2 mL/管），蒽酮-硫酸法跟蹤測定多糖含量，收集主峰的部分，蒸餾水透析24 h，然后減壓濃縮，冷凍干燥得純化POP樣品。

色譜條件：Phenomenex-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；示差折光檢測器；以乙腈-磷酸鹽（pH 6.8)緩沖液（18∶82，V/V）為流動相；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；流速：1 mL/min；進樣體積：20 μL。

標準單糖衍生化：取100 μL 10 種標準單糖（果糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖，質量濃度均為0.5 g/L，等比例混合）的混合溶液加入到1 mL的具塞試管中，然后再加100 μL 0.6 mol/L氫氧化鈉溶液，混勻。取50 μL的混合液于5 mL的具塞試管中，加入50 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液，振蕩混勻，70 ℃水浴反應100 min，取出放置10 min冷卻至室溫，加0.3 mol/L的鹽酸溶液50 μL中和，加水至1 mL，加入等體積氯仿，晃搖，靜置，除去氯仿相，如此反復萃取3 次，0.45 μm水相微孔膜過濾后供高效液相色譜進樣分析，參考文獻[30]。

取100 μL含量較多的POP-A組分（5 g/L）溶液至5 mL的具塞試管內，加入100 μL的4 mol/L TFA，充N2封管，110 ℃烘箱中水解2 h，冷卻后開蓋，加入200 μL甲醇，之后用N2吹干，如此反復3 次，徹底除去TFA。然后加入50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，將殘渣充分溶解，再加入50 μL 0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液，振蕩混勻，70 ℃水浴反應100 min，冷卻之后用單糖衍生化法中和、萃取，并用微孔膜過濾后供高效液相色譜進樣分析。

1.4 數據統計與分析

采用Design-Expert 8.0、Excel等分析軟件對所得數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶液-樣液體積比對多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖1 酶液-樣液體積比對脫蛋白效果的影響Fig. 1 Effect of enzyme to sample ratio on deproteinization efficiency

由圖1可以看出，當溶液pH 6.0、60 ℃水浴中酶解3 h后，隨著木瓜蛋白酶加入量的增大，蛋白去除率逐漸增大，在體積比為0.2∶1～0.3∶1范圍內增長緩慢，分析其原因可能是隨著酶液-樣液體積比的增加，酶與底物反應更完全，蛋白去除率效果明顯，但當溶液中的酶含量達到一定濃度時，蛋白去除率已趨于最大值。同時隨著木瓜蛋白酶加入量的增大，多糖損失率先增加后降低之后，在體積比為0.25∶1～0.3∶1時，有稍微的平緩上升，但不明顯。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定酶液-樣液的較佳體積比為0.2∶1。

2.1.2 酶解時間對多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖2 酶解時間對脫蛋白效果的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on deproteinization efficiency

由圖2可看出，蛋白去除率隨著酶解時間的延長而增大，但當酶解時間為3～3.5 h時，蛋白去除率變化不明顯。多糖損失率則隨時間的延長逐漸增加。因此，綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定較佳酶解時間為3 h。

2.1.3 酶解溫度對多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖3 酶解溫度對脫蛋白效果的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on deproteinization efficiency

由圖3可以看出，隨著酶解溫度的升高，蛋白去除率先逐漸增加，在60 ℃時達到最大，隨后隨著溫度的上升出現下降趨勢。多糖損失率隨著酶解溫度的上升先增加后減少，但在60 ℃后又逐漸上升，可能是因為隨著溫度的上升，酶的活性降低，與底物反應的能力減弱。同時，多糖損失率在40～50 ℃迅速增加，50～60 ℃出現下降趨勢，之后又出現上升趨勢，可能原因是在溫度偏低的條件下木瓜蛋白酶對多糖的降解作用會先于對蛋白的降解。當溫度達到最佳時，木瓜蛋白酶對蛋白的降解作用加強，對多糖的作用減弱，隨著溫度的升高，溫度又對多糖產生一定的降解作用。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定較佳酶解溫度為60 ℃。

2.1.4 pH值對多糖損失率和蛋白去除率的影響

圖4 pH值對脫蛋白效果的影響Fig. 4 Effect of pH value on deproteinization efficiency

由圖4可知，蛋白去除率在pH 3.5～6.5之間逐漸增加，隨后呈現下降趨勢；多糖損失率隨pH值的升高呈現波動狀態。這是由于木瓜蛋白酶的化學本質是蛋白質，其在水解體系中的解離狀態和行為要受溶液pH值的影響，同時，在微酸或者微堿的環境中會加劇多糖的降解，這也可能是多糖損失率呈現較大波動的原因。綜合考慮蛋白去除率和多糖損失率，確定較佳pH值為6.0。

2.2 響應面試驗結果

通過響應面法對酶液-樣液體積比、酶解時間、酶解溫度、pH值進行分析，以POP中蛋白去除率與多糖損失率的比值（蛋白去除率/多糖損失率）為響應值，得到試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

通過Design-Expert 8.0軟件分析表2試驗數據，擬合得到POP的蛋白去除率/多糖損失率（Y）和酶液-樣液體積比（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）、pH值（D）的方程為Y=7.48+0.072A+0.21B+0.7C-0.081D-0.47AB-0.22AC-0.23AD-0.17BC+0.19BD-0.062CD-0.5A2-1.29B2-1.41C2-2.33D2。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variances for the developed regression equation

由表3可知，回歸模型極顯著，失擬項不顯著，且R2為0.983 9，表明自變量與響應值之間的模型關系顯著，即可用此模型分析和預測酶法除去POP中蛋白的結果。F值可以反映出各因素對試驗響應值的影響大小，由表3可知，影響的主次順序為酶解溫度＞酶解時間＞pH值＞酶液-樣液體積比，其中，酶解溫度對方程的影響極顯著。對模型各項進行方差分析可知，模型中C、B、AB、A2、B2、C2、D2對響應值的變化起到不同程度的顯著作用，且與Y的變化不是單一的線性變化。

圖5 各因素交互作用的響應面圖Fig. 5 Response surface plots and corresponding contour plots showing the interaction effects of various parameters

由圖5a可以看出，當酶解溫度、pH值取固定值時，酶液-樣液體積比與酶解時間對蛋白去除率/多糖損失率的交互作用明顯。當酶液-樣液體積比取不同值時，酶解時間對蛋白去除率/多糖損失率的影響表現出不同程度的變化；同理，當酶解時間取不同值時，酶液-樣液體積比對蛋白去除率/多糖損失率的影響也表現出不同程度的變化。從單個因素對蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解時間對蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶液-樣液體積比。由圖5b可以看出，當酶解時間、pH值取固定值時，酶液-樣液體積比與酶解溫度對蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。但從單個因素對蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解溫度對蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶液-樣液體積比。由圖5c可以看出，當酶解時間、酶解溫度取固定值時，酶液-樣液體積比與pH值對蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個因素對蛋白去除率/多糖損失率的影響看，pH值對蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶液-樣液體積比。由圖5d可以看出，當酶液-樣液體積比、pH值取固定值時，酶解時間與酶解溫度對蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個因素對蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解溫度對蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于酶解時間。由圖5e可以看出，當酶液-樣液體積比、酶解溫度取固定值時，酶解時間與pH值對蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個因素對蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解時間對蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于pH值。由圖5f可以看出，當酶液-樣液體積比、酶解時間取固定值時，酶解溫度與pH值對蛋白去除率/多糖損失率的交互作用不顯著。從單個因素對蛋白去除率/多糖損失率的影響看，酶解溫度對蛋白去除率/多糖損失率影響的顯著性大于pH值。

經軟件分析計算得各因素水平最佳取值為酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解時間3.03 h、酶解溫度62.45 ℃、pH 5.98。在此條件下的蛋白去除率為78.22%，多糖損失率為10.39%，蛋白去除率/多糖損失率比值為7.528。

2.3 POP分離純化與鑒定結果

圖6 POP分離純化曲線Fig. 6 Isolation and purification of POPs

纖維素DEAE-52交換層析對粗提POP進行分級的洗脫曲線如圖6a所示。0.2 mol/L NaCl溶液洗脫下來的多糖洗脫量最多，0.3 mol/L NaOH溶液洗脫下來的多糖次之，0.1 mol/L及0.4 mol/L NaCl溶液洗脫下來的多糖洗脫量較少。因此，得到了2個主要組分，依次命名為POP-A和POP-B，再用凝膠Sephadex G-200進行進一步純化，收集分子質量較集中的組分，作為進一步研究的對象，見圖6b和6c。

2.4 POP高效液相色譜分析

圖7 標準單糖的高效液相色譜圖Fig. 7 HPLC profiles of monosaccharide standards

圖8 POP的單糖高效液相色譜圖Fig. 8 HPLC profiles of monosaccharides derived from POP

從圖7和圖8可知，POP-A單糖衍生化后得到了很好的分離。POP-A的單糖組成為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其組成比例為5.3∶5.9∶1.3∶27.6∶1∶18.8∶14.6。

3 結 論

本實驗采用木瓜蛋白酶法對POP溶液進行脫蛋白處理，以蛋白去除率和多糖損失率為評價指標，利用Design-Expert 8.0軟件對實驗結果進行分析，結果表明木瓜蛋白酶法脫馬齒莧多糖蛋白的優化條件為酶液-樣液體積比0.2∶1、酶解溫度62.45 ℃、酶解時間3.03 h、pH 5.98，但考慮到實際條件，對上述優化條件進行修正，最終確定優化條件為酶液-樣液的體積比0.2∶1、酶解溫度60 ℃、酶解時間3 h、pH 6，在此條件下蛋白去除率為78.22%，多糖損失率為10.39%，蛋白去除率/多糖損失率比值為7.528。

粗提POP經過纖維素DEAE-52交換柱層析初步分級后得到主要組分，然后經Sephadex G-200柱層析進一步純化后得到純化多糖，冷凍干燥后為灰黃色棉花狀固體粉末。利用高效液相色譜進一步分析表明，POP的單糖組成是甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，其組成比例為5.3∶5.9∶1.3∶27.6∶1∶18.8∶14.6，為進一步開發和利用POP提供參考依據。