秈米中淀粉粒結合蛋白的分離鑒定及提取工藝優化

陳蘭煊，楊 陽，易翠平*

（長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114）

淀粉粒結合蛋白（starch granule-associated proteins，SGAPs）是指緊密結合于淀粉表面及內部、具有顯著特征的一類蛋白質[1]，占秈米質量分數的0.2%～0.5%；它不同于普通蛋白，多以酶的形式存在于淀粉顆粒中決定其結構及形態[2]，并對淀粉的糊化特性[3]、顆粒性質及整個谷物體系的品質有著重要影響[4]，以顆粒淀粉合成酶（granule-bound starch synthase，GBSS）最為典型[5-6]。但由于秈米SGAPs含量低、組分復雜，又與淀粉顆粒結合緊密[7-8]，相關研究不易開展，關于秈米中SGAPs研究鮮有報道，國內外研究主要集中在小麥和玉米等谷物中。目前，谷物SGAPs的分離主要采用NaCl溶液、2-丙醇、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）和二硫蘇糖醇等強極性溶液進行攪拌浸泡[9-12]；但文獻[13-15]指出，這種分離方法并不能將小麥SGAPs全部提取，Sargeant等[15]報道采用NaCl溶液僅能提取小麥總SGAPs的10%，Turnbull等[14]證明采用10% SDS溶液提取小麥SGAPs效率更高。因此，本研究擬采用SDS緩沖液提取秈米SGAPs，對所提取SGAPs進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離及高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatographtandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）鑒定；以響應面法優化SDS添加量、沸水浴時間、不同金屬離子對秈米SGAPs分離純化的工藝條件。為進一步分離及分析SGAPs組分對秈米基本品質的影響提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秈米：浙富802；SDS、丙三醇（甘油）、2-巰基乙醇、乙醇、三（羥甲基）氨基甲烷、溴酚藍、甘氨酸、考馬斯亮藍G250、N,N-亞甲基丙烯酰胺、丙烯酰胺（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；過硫酸銨（分析純） 西隴科學股份有限公司；乙酸、甲醇、磷酸（均為分析純） 廣東省化學試劑工程技術研究開發中心。

1.2 儀器與設備

Triple TOF?5600 HPLC-MS/MS儀、Eksigent nanoLC-Ultra? 2D納升液相系統 美國AB SCIEX公司；5418R型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Savant DNA120離心濃縮儀 美國Thermo Fisher公司；UV-2800型分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；AVY120型分析天平 北京賽多利斯天平有限公司；DK-2000-L型恒溫水浴鍋、FW100型萬能粉碎機、HJ-1型磁力攪拌器 天津泰斯特儀器有限公司；DHG-9140A型鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；DYCZ型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 秈米淀粉制備

取過100 目的脫脂秈米粉，以0.045 mol/L NaOH溶液洗去蛋白，重復5 次，3 500 r/min離心，得到上層黃淀粉糊、中層白淀粉、下層黃淀粉（以下簡稱上、中、下層），用0.1 mol/L HCl溶液調pH值中性，洗滌、離心、低溫烘干，4 ℃貯藏備用[16-17]。

1.3.2 SDS-PAGE分析蛋白亞基

根據Laemmli[18]的方法：采用不連續緩沖系統，分離膠12%，濃縮膠4%，膠板厚度1.0 mm，進樣量15 μL，在80 V穩流電壓下電泳，樣品條帶至膠板底部1 cm左右停止，采用考馬斯亮藍G250染色約4 h，脫色至條帶清晰。

1.3.3 HPLC-MS/MS鑒定

樣品經SDS-PAGE得到60 kDa亞基條帶，經胰蛋白酶充分酶解得到上清液，離心濃縮干燥后得到胰酶切多肽[19-21]。將胰酶切多肽溶解入Nano-RPLC流動相A（0.1%甲酸溶液，2%乙腈溶液），裝瓶上樣到C18預柱（100 μm×3 cm，3 μm，150 ?），進行在線HPLC-MS/MS分析：流動相流速2 μL/min、10 min，液相采用C18反相色譜柱（75 μm×15 cm，3 μm，120 ?，Chrom XP Eksigent）分離，梯度洗脫為60 min內流動相B（0.1%甲酸，95%乙腈溶液）由5%升高至40%。質譜采用Triple TOF?5600系統結合納升噴霧III離子源，噴霧電壓為2.3 kV，氣簾氣壓為30 psi，霧化氣壓為5 psi，加熱溫度為150 ℃，質譜掃描方式為信息依賴的采集工作模式下，一級飛行時間質譜單張圖譜掃描時間為250 ms，每次采集工作模式循環下最多采集35 個電荷為2+到5+且單秒計數大于200 cps的二級圖譜，每張二級圖譜的累積時間為60 ms。每次循環時間固定為2.5 s，碰撞室能量設定適用于所有前體離子碰撞誘導解離，動態排除設置為12 s，約等于色譜半峰寬。

1.3.4 SGAPs的分離純化

1.3.4.1 SGAPs的提取及測定

分別取1.0 0 g樣品，加入S D S提取液（3%～12% SDS，5%巰基乙醇，10%甘油，62.5 mmol/L Tris，pH 6.9），攪拌均勻，沸水浴加熱，冷卻至室溫后15 000 r/min離心15 min，考馬斯亮藍G250染色法測定上清液的蛋白含量[22]。

1.3.4.2 單因素試驗

以樣品煮沸時間3 min、MgSO4濃度0.75 mmol/L、SDS添加量9%為基本條件，改變SDS添加量：3%、5%、7%、9%、10%、12%，樣品煮沸時間：1、2、3、4、5 min，濃度均為0.75 mmol/L的金屬離子緩沖液：NaCl、MgCl2、KCl、CaCl2、Na2SO4、K2SO4、CaSO4、MgSO4，MgSO4濃度：0.25、0.5、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50 mmol/L進行單因素試驗。

1.3.4.3 響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以提取SGAPs含量為響應值，選取SDS添加量、煮沸時間、MgSO4濃度3 個因素，設計3因素3水平的響應面分析試驗。各因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Coded levels for independent variables used in response surface analysis

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用Excel 2007、SPSS軟件進行方差分析，Duncan新復極差法進行多重比較；HPLC-MS/MS鑒定采用Maxquant軟件進行數據加工處理和檢索分析，數據庫為Uniprot的oryza sativa japonica物種蛋白數據庫。

2 結果與分析

2.1 秈米淀粉蛋白含量

將秈米粉堿洗5 次后得到上、中、下層淀粉3 個樣品，與秈米粉一起，分析其蛋白質量分數（表2）。結果表明，蛋白質量分數由低到高分別是中層、下層、上層、秈米粉，且經分離后的3層淀粉蛋白質量分數均低于0.5%，與Koziol等[23]報道SGAPs在秈米淀粉顆粒中質量分數為0.2%～0.5%一致，說明殘留淀粉中的蛋白可能是SGAPs。

表2 堿處理秈米粉各組分的蛋白含量分析（n=3）Table 2 Protein content of starch layers of alkali-washed indica rice fl our (dry basis, n= 3)

2.2 蛋白亞基分析

圖1 秈米粉及不同秈米淀粉所提SGAPs的SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE image of SGAPs from indica rice fl our and different rice starch layers

將各層淀粉提取的SGAPs及秈米粉蛋白質進行電泳（圖1），結果表明，與秈米粉蛋白亞基對照，3 層淀粉所提的SGAPs基本一致，均只有60 kDa亞基條帶，說明多次堿洗后以SDS緩沖液提取能有效去除其他雜蛋白，得到較純的SGAPs。其中，中層亞基顏色最深，下層次之，上層最淺，與上、中、下3 層淀粉中的蛋白含量呈相反趨勢，說明上層淀粉蛋白中殘留更多的與淀粉分子結合緊密的儲藏蛋白，如谷蛋白、醇溶蛋白；中層淀粉SGAPs含量最高且更純。

2.3 SGAPs的HPLC-MS/MS鑒定結果

表3 SDS-PAGE條帶HPLC-MS/MS鑒定結果Table 3 HPLC-MS/MS analysis of the bands from SDS-PAGE

對電泳分離的60 kDa蛋白條帶通過HPLC-MS/MS法進行鑒定[24]，結果見表3，3層淀粉中的60 kDa蛋白均是以GBSS I為主的SGAPs，其中上層含A型谷蛋白0.58%、B型谷蛋白1.94%、醇溶蛋白0.15%、GBSS I 97.33%；中層淀粉SGAPs含量較為單一，GBSS I 99.80%、B型谷蛋白僅0.11%，可見SDS緩沖液能有效分離出中層淀粉SGAPs；下層淀粉仍以97.51%的GBSS I為主，A型谷蛋白0.15%、B型谷蛋白0.97%、醇溶蛋白0.06%，除此之外還含0.75%的α-ATP合成酶以及參與細胞代謝、能量調控及DNA轉錄和翻譯的酶類和蛋白，如α伸長因子、60核糖體蛋白L2、NLP1蛋白、丙酮酸磷酸二激酶等。

HPLC-MS/MS結果表明，以SDS緩沖液從秈米淀粉中分離SGAPs的方式可行，能有效提取出SGAPs，且秈米中的SGAPs以GBSS I為主并以主要生物酶的形式負責谷物中的淀粉合成，影響直鏈淀粉與支鏈淀粉的比例[25]。上、中、下3 層淀粉中以中層淀粉的SGAPs含量最高最純，因此選取中層淀粉進行SGAPs提取的優化試驗。

2.4 單因素試驗結果

2.4.1 SDS添加量對SGAPs提取量的影響

圖2 SDS緩沖液添加量對SGAPs提取量的影響Fig. 2 Effect of SDS buffer concentration on the extraction efficiency of SGAPs

如圖2所示，SDS添加量對SGAPs提取量有顯著影響（P＜0.05），隨著SDS添加量加大，SGAPs提取量逐漸升高，當SDS添加量為10%時達到最大提取量，隨著SDS添加量繼續升高，樣品的SGAPs提取量開始有所下降，是由于SDS分子中的長鏈疏水基團與蛋白質分子內部的非極性基團相互作用，打破其原來有序結構[26]，使蛋白質構象發生變化，目標蛋白變性，從而導致SGAPs的提取量降低。因此，提取秈米中SGAPs的最佳SDS添加量為10%。

2.4.2 煮沸時間對SGAPs提取量的影響

由于SGAPs緊密結合于淀粉顆粒內部，即便是鹽濃度很高的提取液或緩沖液在低溫下都很難進入到淀粉分子的內部與其作用[27]。利用高溫條件下淀粉顆粒的糊化作用[28]，淀粉顆粒的內部SGAPs緩慢膨脹并慢慢暴露，與反應試劑發生作用，由此可以分離純化得到SGAPs[29]。因此煮沸時間對SGAPs的提取有重要影響。由圖3可知，當煮沸時間為4 min時SGAPs提取量顯著高于其他條件下提取量（P＜0.05）。而隨著煮沸時間的延長，SGAPs提取量逐漸下降?？赡苁怯捎谝话愕矸垲w粒在溫度達到50 ℃時開始膨脹，反應試劑開始逐漸進入淀粉顆粒內部，當溫度達到90 ℃時淀粉完全糊化[30]，提取試劑最大程度與SGAPs接觸，此時所用時間為4 min，隨著煮沸時間延長，所提SGAPs由于高溫作用已經發生熱變性，導致在測定SGAPs提取量時呈逐漸減少趨勢。

圖3 煮沸時間對SGAPs提取量的影響Fig. 3 Effect of heating time in boiling water bath on the extraction efficiency of SGAPs

2.4.3 金屬離子對SGAPs提取量的影響

圖4 金屬離子對SGAPs提取量的影響Fig. 4 Effect of metal ions on the extraction efficiency of SGAPs

圖5 MgSO4濃度對SGAPs提取量的影響Fig. 5 Effect of magnesium ion concentration on the extraction efficiency of SGAPs

在SDS緩沖液中分別加入了Na+、K+、Mg2+和Ca2+等陽離子以及不同的陰離子Cl-和后，對淀粉顆粒上的SGAPs進行提取。如圖4所示，不同金屬離子對SGAPs的解離有顯著影響（P＜0.05），其中加入MgSO4后從淀粉顆粒上解離的SGAPs最多。由圖5可知，隨著MgSO4濃度的增大，SGAPs提取量呈先增大后減小的趨勢。MgSO4濃度為0～0.75 mmol/L時，SGAPs提取量不斷提高；濃度為0.75 mmol/L時，SGAPs提取量達到最大；當MgSO4濃度大于0.75 mmol/L后，SGAPs提取量逐漸下降。由于共價鍵不隨離子類型與強度的變化而異[31]，秈米SGAPs的解離隨離子類型與強度的變化而變化，因此判斷SGAPs結合力為非共價鍵。

2.5 響應面試驗優化結果

采用Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken設計試驗，結果見表4。

表4 響應面試驗設計與結果Table 4 Experimental design and results for response surface analysis

表5 中層秈米淀粉提取SGAPs回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance for the regression model describing the extraction efficiency of SGAPs

從表5可以看出，一次項A、B、C對SGAPs提取量的影響均達到極顯著水平（P＜0.01）；交互項AB、BC達到極顯著水平（P＜0.01），交互項AC不顯著（P＞0.05），二次項A2、B2、C2、D2均達到極顯著水平（P＜0.01）。其中模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.220 6＞0.05），模型決定系數R2值為0.991 9，校正決定系數值為0.998 3，說明該模型能較好地反映SGAPs提取量與SDS添加量、煮沸時間、MgSO4濃度之間的關系，由此可見，這種試驗方法是可靠的。

圖6 因素交互作用對中層秈米淀粉SGAPs提取量的影響Fig. 6 Response surface plots showing interactive effects of various factors on the extraction efficiency of SGAPs

由表5可知，SDS添加量、煮沸時間與MgSO4濃度均為影響淀粉SGAPs提取量的主要因素，各因素間交互影響分別如圖6所示。SDS添加量與MgSO4濃度交互作用不顯著（圖6b），其余2 組交互顯著，與表5方差分析結果一致。等高線呈橢圓形，表明煮沸時間與SDS添加量、MgSO4濃度間交互作用對SGAPs提取量有顯著影響，此與單因素試驗結果一致。

利用Design-Expert 8.0.6.1軟件對樣品提取SGAPs的工藝條件進行優化，得到SGAPs最優提取條件：SDS添加量10.95%、煮沸時間4.14 min、MgSO4濃度0.92 mmol/L。為方便工藝操作，將SGAPs提取最佳條件均修正為SDS添加量10.90%、煮沸時間4.10 min、MgSO4濃度0.90 mmol/L。在該條件下進行驗證實驗，分別得到SGAPs提取量實測值為（1 028.61±0.05）μg/g，與預測值1 037.28 μg/g非常接近。

3 結 論

堿洗秈米粉可以得到上、中、下3 層淀粉，SDS緩沖液提取、HPLC-MS/MS鑒定表明，不同淀粉層中的SGAPs均以GBSS I為主，其中以中層淀粉SGAPs含量最高，達99.80%。至于秈米粉中的GBSS I是否具有生理活性、在秈米的加工過程中能否因為其生理活性而對產品產生影響尚不得而知。響應面優化中層淀粉SGAPs提取參數，結果表明SDS添加量10.90%、煮沸時間4.10 min、MgSO4濃度0.90 mmol/L，SGAPs的提取量最大，達（1 028.61±0.05）μg/g。當然，這種條件下提取的SGAPs顯然不可能是具有活性的酶，但同樣可以考慮這種SGAPs僅作為蛋白質對于秈米基本品質的影響，至于具有酶活性的SGAPs分離提取方法，則需要進一步研究。