超高效合相色譜對植物油中角鯊烯的快速測定及方法比較

王 強，陸秀云，謝躍杰，任貴禮，劉倩倩，王 波

（1.重慶第二師范學院生物與化學工程學院，重慶 400067；2.西北師范大學地理與環境科學學院，甘肅 蘭州 730070；3.重慶江源油橄欖開發有限公司，重慶 404100；4.甘肅出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心，甘肅 蘭州 730000）

角鯊烯又名鯊烯、三十碳六烯，是一種高度不飽和的直鏈三萜類化合物，角鯊烯是重要的天然活性物質。角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發現的，是一種脂質不皂化物，其生理功能主要包括抗氧化作用，抗輻射作用，提高體內超氧化物歧化酶活性、增強機體免疫能力、抗衰老等；同時因為抗腫瘤、抗癌活性而應用于藥物和保健品中，是一種無毒性的具有防病治病作用的活性物質[1-3]。大豆油、菜籽油、棉籽油等植物油中含有少量角鯊烯，但在橄欖油中含量較多[4-6]。

目前，文獻報道的角鯊烯檢測方法主要是氣相色譜[7-10]、氣相色譜-質譜法[11-16]和液相色譜法[17-23]。采用的預處理方法除了皂化法外，還有溶劑稀釋法、溶劑分級重結晶法。國際上僅有的官方發布的測定角鯊烯含量的方法是AOAC[24]，該方法包含樣品皂化，用大量溶劑萃取不皂化物，通過柱色譜分離以及滴定前的其他處理步驟，整個檢測過程繁瑣、費時費力、誤差較大。因此，建立一種快速的檢測方法在實際樣品檢測中具有廣泛的應用前景。

超高效合相色譜（ultra-performance convergence chromatography，UPC2）是將傳統超臨界流體色譜與超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）的技術特點相互補充，相比傳統超臨界流體色譜而言，在精密度及穩定性上得到大幅度提高，此外，由于UPC2以CO2超臨界流體為流動相主體，在色譜保留特性及原理與傳統反相或正相色譜有著很大區別[25-28]。理論上講，UPC2不僅可分析氣相色譜不適應的高沸點、低揮發、熱不穩定的樣品，還能夠對結構類似物、脂溶性化合物以及熱不穩定化合物等多種物質進行分離[29-32]。

本實驗主要采用UPC2測定植物油中角鯊烯的含量，在2.5 min內實現了分離。實驗證明，此法快速、樣品預處理簡便、實用性強。實現了植物油中角鯊烯的快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物油樣品均購自本地超市，樣品編號及名稱見表1。為防止所取樣品變質而影響數據的準確性，樣品均避光冷藏保存。

表1 實際樣品Table 1 List of actual samples

角鯊烯（純度＞98%） 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；CO2（純度＞99.997%） 蘭州匯能公司；其余試劑如無特殊說明則均為分析純。

1.2 儀器與設備

Acquity UPC2儀、Acquity UPLC儀 美國Waters公司；電子天平（±0.01 g） 常熟雙杰測試儀器廠；分析天平（±0.1 mg） 德國Sartorius公司；3K30冷凍離心機 美國Sigma公司；MS3渦旋儀 德國IKA公司；移液槍（100～1 000、20～100 μL） 美國Thermo Electron公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

標準貯備液：分別精確稱取角鯊烯0.21 g，用乙腈溶液準確定容至100 mL容量瓶中，配制成2 100 mg/L的標準儲備液，4 ℃冷藏待用。

標準工作液：分別準確轉移適量標準貯備液至100 mL容量瓶中，乙腈準確定容，配制成相應的標準工作液，4 ℃冷藏待用。

1.3.2 樣品處理

方法1（直接稀釋法）：準確稱取0.10 g植物油樣品于10 mL容量瓶中，正己烷定容至10 mL，混勻后取1.5 mL經0.22 μm有機相膜過濾后裝入進樣小瓶中，直接進行檢測。

方法2（皂化法）：稱取0.10 g植物油于50 mL試管中，加入10 mL石油醚，搖勻。再加入20 mL 0.3 mol/L的氫氧化鈉-甲醇溶液，振搖，在常溫下放置至溶液澄清無油滴，加飽和氯化鈉水溶液至刻度，靜置分層，取上清液1.5 mL經0.22 μm有機相膜過濾后進樣。

方法3（滴定法）：除樣品稱樣量稍作改動外，其余步驟均按照AOAC Hicial Method 943.04[11]方法進行處理。

1.3.3 色譜條件

1.3.3.1 UPLC條件

采用Acquity UPLC BEH柱（3.0 mm×50 mm，1.7 μm）進行定量分析。流動相選用乙腈溶液。檢測波長215 nm，流速0.3 mL/min，柱溫30 ℃，進樣量2.0 μL；使用Empower軟件進行數據處理。

1.3.3.2 UPC2條件

采用Acquity UPC2HSS C18SB柱（3.0 mm×100 mm，1.7 μm）進行定量分析。流動相A選用CO2，助溶劑B為乙腈溶液。洗脫梯度為：0～0.2 min，助溶劑B，初始1%，0.2～4.0 min助溶劑B比例由1%變為20%，4.0～5.0 min助溶劑B比例回到1%，平衡2.0 min。流速1.5 mL/min，檢測波長215 nm，動態背壓12.4 MPa，柱溫50 ℃，進樣量1.0 μL；數據處理使用Empower 3軟件。

2 結果與分析

2.1 色譜柱的優化

在實際分離過程中，為了在較短時間內使目標物獲得良好的分辨率和峰形，比較HSS SB C18和CSH Fluorophenyl柱對目標物分離的影響。當色譜柱為CSH Fluorophenyl時，樣品經皂化后的某一雜質與角鯊烯未能分離，影響其定量的準確性。當使用HSS SB C18色譜柱時，角鯊烯與此雜質能夠較好地分離，且峰形尖銳，分析時間僅2.5 min，故本實驗選用HSS C18SB柱為分析色譜柱。

2.2 分離條件的優化

圖1 角鯊烯標準的UPLC（A）和UPC2（B）圖Fig. 1 UPLC (A) and UPC2 (B) chromatograms of squalene standard

為達到快速分離角鯊烯的目的，本實驗分別優化了流速（1.0～2.0 mL/min）、動態背壓（10.3～13.8 MPa）、進樣量（0.5～3.0 μL）、助溶劑（乙腈、甲醇）以及柱溫（40～60 ℃）對角鯊烯分離的影響。通過綜合考慮系統最高壓力的限制以及樣品中雜質與目標化合物的分離度，實驗最終結果為流速1.5 mL/min，動態背壓12.4 MPa，進樣量1.0 μL，乙腈作為助溶劑，柱溫為50 ℃時，角鯊烯與雜質完全分離。最佳條件下的角鯊烯標準色譜圖見圖1。

2.3 樣品前處理優化及比較

液相色譜對于角鯊烯的測定原理基本相同，均使用紫外檢測器在210～215 nm波長處進行檢測。此外，目前主要的前處理方法主要包括3 類，具體描述見表2，關于角鯊烯的前處理方法，方法1為溶劑直接稀釋法，此法雖然只需兩步即可完成檢測，但是此法對于反相色譜而言，易對色譜柱造成損害，基質效應較高，而且過多的雜質峰對角鯊烯的峰形產生干擾；方法2為通過對植物油經皂化后提取進行檢測，此法增加了皂化，基質效應明顯降低，并且能夠很好地適應于UPLC的檢測，但是前處理時間較長，不能完成快速檢測要求；其次為AOAC的滴定方法，此法操作繁瑣，不僅樣品前處理的時間較長；而且實驗重復性較差，對實驗人員操作技能要求較高。綜合以上前處理的優缺點可知，方法1和方法2均適合使用UPC2對植物油中的角鯊烯進行檢測，且方法1具有更快的前處理速率；方法2則適用于液相色譜對角鯊烯的檢測；在沒有儀器的前提下，可用方法3對植物油中的角鯊烯進行檢測。

表2 角鯊烯檢測方法的優缺點比較Table 2 Comparison of the advantages and disadvantages of squalene detection methods

2.4 方法學考察結果

2.4.1 線性范圍和最低檢出限

取標準儲備液，稀釋成5 個質量濃度梯度，按1.3.3節優化后色譜條件進行測定，并繪制樣品質量濃度（橫坐標x，mg/L）與峰面積（縱坐標y，AU）標準曲線，進行線性回歸分析，且當信噪比為3和10時，該方法的最低檢出限及定量限如表3所示。結果表明，使用該方法對目標物的檢測，在線性范圍內具有良好的線性（r＞0.999 1），均能滿足對植物油中的角鯊烯進行檢測的要求。

表3 角鯊烯的線性范圍及檢出限Table 3 Linear ranges and limits of detection for squalene

2.4.2 樣品加標回收率和精密度實驗結果

在空白樣品中添加高、中、低水平的角鯊烯標準溶液，渦旋2.0 min后靜置10 min，按2.3節樣品處理進行前處理操作后，按1.3.3節色譜條件進行加標回收實驗，計算回收率。每加標水平的樣品重復測定8 次。結果顯示，加標回收率在86.97%～102.41%之間，相對標準偏差在1.3%～4.1%之間。

表4 加標回收率實驗結果（n=8）Table 4 Recoveries of UPC2 and UPLC (n= 8)

2.4.3 UPC2與UPLC檢測方法的比較

為進一步確定方法的準確性，本課題組隨機抽取3 個植物油樣品對不同的檢測方法進行比對實驗，按2.3節樣品處理進行前處理操作后，按1.3.3節色譜條件進樣測定，結果如表5所示。

表5 不同檢測方法的比對結果（n=3）Table 5 Comparison of squalene determination in vegetable oils by UPC2 and UPLC (n= 3)

由表5可知，UPC2實驗結果與UPLC實驗結果基本一致，由此可以證明UPC2與UPLC均能滿足檢測要求，檢測方法可靠，相對于UPLC法，UPC2不但可以節約檢測時間與檢測成本，還可大大提高檢測效率，可認為是一種全新的檢測方法。

2.5 實際樣品的檢測結果

圖2 皂化后菜籽油樣品（A）、橄欖油樣品（B）的UPLC圖和UPC2圖（C）以及直接稀釋后橄欖油樣品的UPC2圖（D）Fig. 2 UPLC chromatogram of saponified rapeseed oil (A), olive oil (B), UPC2 chromatogram of saponified olive oil (C) and UPC2chromatogram of diluted olive oil sample (D)

本實驗在實際樣品檢測過程中，采用3 種前處理方法分別對不同種類的植物油進行檢測。首先，不同植物油樣品（編號：CZY001、GLY018）使用傳統檢測方法2進行處理的UPLC見圖2A、B；其次，同一樣品（編號：GLY018）使用不同前處理方法（方法1、方法2）的UPC2見圖2C、D，可以看出，UPC2因為超臨界流體作為流動相而使得色譜保留的性質與傳統反相液相色譜不同，不僅適用于傳統的方法2，而且同樣適用于簡單快速的方法1。由表6可知，除橄欖油中角鯊烯含量較高以外，菜籽油、花生油等植物油中角鯊烯含量較少；且UPLC和UPC2均能較為準確地檢測出橄欖油中角鯊烯的含量，而滴定法測得角鯊烯含量均較高，且處理時間長，穩定及重復性較差。

表6 實際樣品檢測結果（n=3）Table 6 Squalene contents of real samples determined by UPC2 and UPLC with different sample pretreatments (n= 3)g/kg

3 結 論

綜上所述，使用UPC2以及UPLC對植物油中角鯊烯的檢測結果比較可以看出，由于分離原理以及流動相的不同，對植物油中角鯊烯的檢測具有獨特的分離優勢。而滴定法準確度不高，重復性不好，且操作過程繁雜，不適應大批量樣品的快速檢測。通過3 種前處理方法的比較，UPC2可兼容樣品經正己烷稀釋后直接進樣，且分離過程中對目標物基本無干擾，檢出限低，分離速率快，適合對植物油中角鯊烯進行高通量檢測；并對未來的分析提供新的方向及思路。