堿性木聚糖酶產(chǎn)生菌株的分離鑒定與產(chǎn)酶分析

甘雅霆，周 慧，李 艷，董重實(shí)，趙 碩，閆達(dá)中,*

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049）

木聚糖酶（1,4-β-D-xylanase，EC3.2.1.8）屬水解酶類，是將木聚糖降解為低聚木糖或木糖的復(fù)合酶系。該酶在自然界的來(lái)源廣泛，諸如細(xì)菌（如枯草芽孢桿菌、黃熱芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌、拜氏梭菌、耐鹽高溫雙歧菌）、真菌（如木霉、青霉、米曲霉、黑曲霉、土曲霉）、放線菌、蝸牛等[1-3]。木聚糖酶有重要的工業(yè)價(jià)值，已應(yīng)用于食品、造紙、飼料、能源和環(huán)境眾多領(lǐng)域，尤其是在食品制作和紙漿生物漂白中有著不可小覷的重要性[4]。據(jù)澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局消息，2017年7月7日澳新食品標(biāo)準(zhǔn)局發(fā)布17-17號(hào)通報(bào)，批準(zhǔn)一種木聚糖酶作為加工助劑用于谷物食品生產(chǎn)。據(jù)了解，2017年1月23日，Puratos NV公司提交A1125號(hào)申請(qǐng)，申請(qǐng)木聚糖酶作為內(nèi)切酶使用于谷物產(chǎn)品生產(chǎn)并提交相應(yīng)草案。該木聚糖酶由轉(zhuǎn)基因枯草芽孢桿菌產(chǎn)生。它能催化阿拉伯木聚糖轉(zhuǎn)化成阿拉伯木聚糖寡糖，提高這些多糖的功能特性，取得更好或更穩(wěn)定的產(chǎn)品質(zhì)量，可用于面包、餅干、蛋糕等烘培食品，還有面食、面條、小吃等谷物產(chǎn)品[5]。此外，木聚糖酶在紙漿漂白中取代毒性化學(xué)物質(zhì)的同時(shí)通過(guò)酶法預(yù)處理還能有效回收副產(chǎn)物，降低化學(xué)漂白劑用量，改善漂白效果，具有良好的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益。

不同來(lái)源的木聚糖酶最適pH值不同，真菌接近于酸性，大部分放線菌和細(xì)菌接近于中性。最適反應(yīng)溫度大多在50～60 ℃左右，大大制約了木聚糖酶在工業(yè)中高溫高堿環(huán)境下的應(yīng)用[6]。由于來(lái)源于細(xì)菌的木聚糖酶的耐堿性和熱穩(wěn)定性方面要優(yōu)于真菌和放線菌，所以成為目前工業(yè)用木聚糖酶的研究熱點(diǎn)[4,7]。本研究從造紙廠的活性污泥中分離篩選產(chǎn)堿性木聚糖酶的菌株，并對(duì)1 株高產(chǎn)酶菌進(jìn)行鑒定，以期為細(xì)菌木聚糖酶的研究和工業(yè)化應(yīng)用提供細(xì)菌菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

從武漢漢陽(yáng)晨鳴造紙廠的活性污泥和污水排放口附近的泥土中分別多點(diǎn)采樣。

1.1.2 試劑

樺木木聚糖 美國(guó)Sigma公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）（分析純） 溴百里酚藍(lán)、結(jié)晶紫、番紅、醋酸鉛濾紙以及其他化學(xué)試劑（均為分析純） 中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑公司；dNTP Mix、Taq酶 寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 引物

引物均購(gòu)自生工生物工程（武漢）有限公司。正向引物27F（5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）；反向引物1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）。

1.1.4 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：木聚糖1 g/L，硝酸鉀1 g/L，氯化鈉0.2 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，硫酸銨0.3 g/L，pH 8.5。配制固體培養(yǎng)基時(shí)加20 g/L瓊脂粉。種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，氯化鈉5 g/L，pH 8.5。基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：木聚糖1 g/L，酵母膏2 g/L，玉米漿5 mL/L，硫酸鎂0.2 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀0.5 g/L，pH 8.5。復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基：葡萄糖1.5 g/L，酵母粉4 g/L，玉米漿15 mL/L，硫酸鎂1 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，氯化鈣15 g/L，pH 8。LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，氯化鈉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH 7。

1.2 儀器與設(shè)備

LAMBDA? 25 Series紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)美國(guó)PerkinElmer公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 德國(guó)耶拿分析儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離

分別稱取活性污泥10 g，接種于250 mL液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于170 r/min、28 ℃搖床培養(yǎng)7 d。取5 mL培養(yǎng)物接入液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，重復(fù)3 次。取最終培養(yǎng)物稀釋成不同濃度梯度，在10-6～10-8梯度取稀釋菌液0.2 mL涂布于選擇培養(yǎng)基平板，入培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)，挑取透明圈較大并具有細(xì)菌形態(tài)的單菌落進(jìn)行分離、純化，直至得到均勻的單菌，于1 mL 20%甘油的LB培養(yǎng)基中-20 ℃保藏。

1.3.2 高產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

初篩：從分離得到的7 株單菌落分別接入150 mL的種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h。分別取100 μL培養(yǎng)物接種到100 mL基礎(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基，于28 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)24 h，加入0.01 g/L木聚糖溶液3 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)24 h后，測(cè)定波長(zhǎng)600 nm處的光密度（OD600nm），同時(shí)將發(fā)酵液6 000 r/min離心，取粗酶液，測(cè)其酶活力。

復(fù)篩：對(duì)7 株中酶活力最高的1號(hào)菌株，命名為YD01，進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽平板涂布培養(yǎng)，隨機(jī)挑3 個(gè)單菌落分別接種于50 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基28 ℃、170 r/min搖床培養(yǎng)，至OD600nm達(dá)到0.4～0.6時(shí)加入0.01 g/L木聚糖溶液3 mL，12 h后取1 mL菌液接種200 mL復(fù)篩產(chǎn)酶培養(yǎng)基于28 ℃、170 r/min培養(yǎng)48 h，將發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取上清粗酶液，測(cè)其酶活力。

1.3.3 DNS定糖法測(cè)定木聚糖酶活力[8]

取0.5 mL稀釋粗酶液入試管，加入1.0 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的木聚糖溶液，搖勻，50 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入2.5 mL DNS試劑搖勻后沸水浴加熱10 min，待冷卻至室溫后加入8.5 mL蒸餾水定容到12.5 mL，搖勻，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處OD值。每組3 次重復(fù)，取其平均值。空白對(duì)照組則預(yù)先將酶加熱失活處理，其余步驟同實(shí)驗(yàn)組。將每分鐘生成1 μmol還原糖（以木糖計(jì)）所需酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）。還原糖（木糖）標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.710 0x-0.111 5，R2=0.994 9。酶活力計(jì)算公式如下：

式中：E為樣品酶活力/U；D為稀釋倍數(shù)（200）；A為酶液反應(yīng)的OD值；S為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；I為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；M為木糖的分子質(zhì)量（150.13 Da）；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

1.3.4 菌種培養(yǎng)及形態(tài)特征鑒定

將YD01菌液劃線于LB平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形狀、大小、顏色、水溶性色素等特征，進(jìn)行革蘭氏染色[9]。

1.3.5 菌落PCR擴(kuò)增及16S rRNA測(cè)序

將YD01菌液劃線于無(wú)機(jī)鹽平板，28 ℃培養(yǎng)24 h，煮沸法提取基因組RNA。采用細(xì)菌通用引物27F和1492R PCR擴(kuò)增16S rRNA。PCR擴(kuò)增體系50 μL，包括ddH2O 37.5 μL，PCR Buffer（10×）5 μL，引物P1（27F）、P2（1492R）各1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 1 μL，Taq酶（含Mg2+）0.5 μL，模板4 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送交生工武漢測(cè)序部測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交GenBank（Accession Number：MF443454），進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用Clustal W和MEGA 6.05軟件進(jìn)行分析，Neighbor-Joinning法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 生理生化鑒定分析

糖、醇類發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，H2S實(shí)驗(yàn)，細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性觀察實(shí)驗(yàn)，V-P實(shí)驗(yàn)，加熱存活實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[9]，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照微桿菌屬不同種的特征確定YD01的菌種[10]。

1.3.7 木聚糖酶最適pH值、最適溫度測(cè)定

配制pH值分別為6.0～10.0的Na2HPO4-NaH2PO4和甘氨酸-NaOH緩沖液，將粗酶液加到相應(yīng)pH值buffer，按照1.3.3節(jié)測(cè)定50 ℃酶活力。以相同方法在溫度分別為40、50、60、70、80 ℃條件下測(cè)定pH 8.0的酶活力。1.3.8 木聚糖酶pH值穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性測(cè)定

將粗酶液分別加到pH值為6.0～10.0的緩沖體系中保持1 h后同法測(cè)定50 ℃酶活力，以其最適溫度對(duì)應(yīng)的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。將粗酶液分別置于40、50、60、70、80 ℃保溫1 h后，同法測(cè)定pH 8.0的酶活力，以其最適pH值對(duì)應(yīng)的酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.4 數(shù)據(jù)與圖像處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，數(shù)據(jù)以 ±s表示，應(yīng)用Origin 8.5軟件進(jìn)行擬合分析，Excel 2007軟件進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平選取P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)木聚糖酶菌株的分離

圖1 產(chǎn)酶菌株在平板上形成的透明圈Fig. 1 Transparent halos around the colonies with xylanase activity on the plate

經(jīng)過(guò)3 次連續(xù)傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)物稀釋涂布無(wú)機(jī)鹽平板，得到均勻、水解圈較大且透明的單菌落（圖1）。

2.2 高產(chǎn)木聚糖酶菌株的篩選

2.2.1 初篩菌株生長(zhǎng)情況測(cè)定結(jié)果

挑取能產(chǎn)生透明圈的菌株共7 株。按1.3.2節(jié)方法培養(yǎng)后測(cè)定酶液在波長(zhǎng)為600 nm處的光密度（圖2）。7 株中生長(zhǎng)情況最好的1號(hào)菌株，酶活力亦為最高，命名為YD01。

圖2 不同初篩菌株的24 h培養(yǎng)物的OD600 nmFig. 2 OD600 nm of cultures of 7 isolates after 24 h incubation.

2.2.2 復(fù)篩菌株酶活力測(cè)定結(jié)果

將YD01進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽平板涂布培養(yǎng)后隨機(jī)挑3 個(gè)單菌落，擴(kuò)大培養(yǎng)后測(cè)酶活力（圖3），酶活力最高為36.85 U/mL。

圖3 復(fù)篩菌株酶活力Fig. 3 Xylanase activity of selected strains

2.3 菌株鑒定

2.3.1 YD01菌落形態(tài)

菌落呈桿狀、較濕潤(rùn)、較光滑、較黏稠、易挑起、質(zhì)地均勻、菌落正反面及中央部位的顏色一致。

2.3.2 菌株的革蘭氏染色

以革蘭氏陽(yáng)性枯草芽孢桿菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌為對(duì)照，對(duì)YD01進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果為紫色（圖4），表明YD01為革蘭氏陽(yáng)性菌。

圖4 革蘭氏染色（40×10）Fig. 4 Gram staining (40 × 10)

2.3.3 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及16S rRNA系統(tǒng)進(jìn)化樹

PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，電泳檢測(cè)基因序列長(zhǎng)度約1 433 bp（圖5）。

圖5 YD01的16S rRNA PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 5 Electrophoresis of 16S rRNA PCR products amplified from strain YD01

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳回收后送生工測(cè)序，經(jīng)BLAST同源分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6），它顯示了YD01菌和微桿菌屬其他種菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。根據(jù)同源性遠(yuǎn)近，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹、菌落形態(tài)、顏色及革蘭氏染色結(jié)果確定菌屬，該菌為微桿菌屬（Microbacterium）。

圖6 菌株YD01的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap value 1 000）Fig. 6 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of strain YD01

2.3.4 生理生化鑒定

表1 菌株YD01的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain YD01

如表1所示，菌株YD01的葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為陽(yáng)性；H2S實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性，V-P實(shí)驗(yàn)陰性；37 ℃加熱能存活；能運(yùn)動(dòng)。

2.4 木聚糖酶最適pH值和最適溫度分析

圖7 木聚糖酶最適pH值（A）與最適溫度（B）Fig. 7 Optimum pH (A) and optimum temperature (B) for the xylanase

如圖7所示，木聚糖酶最適作用pH值為8.0，最適作用溫度為50 ℃。pH 10和80 ℃時(shí)，仍有87%和85%的剩余酶活力。

2.5 木聚糖酶pH值穩(wěn)定性與溫度穩(wěn)定性分析

圖8 木聚糖酶pH值穩(wěn)定性（A）與溫度穩(wěn)定性（B）Fig. 8 pH stability (A) and temperature stability (B) for the xylanase

如圖8所示，不同pH值保持1 h后的木聚糖酶在最適pH 8.0時(shí)有80.83%的相對(duì)酶活力，在pH 10時(shí)仍有41.43%的相對(duì)酶活力。保溫1 h后的木聚糖酶在最適作用溫度50 ℃時(shí)有62.33%的相對(duì)酶活力，在80℃時(shí)仍有56.82%的相對(duì)酶活力，表明YD01所產(chǎn)木聚糖酶具備較好的耐堿性和耐高溫能力。

3 討 論

經(jīng)革蘭氏染色、16S rRNA序列分析，確定YD01為微桿菌屬。生理生化結(jié)果則為葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖發(fā)酵陽(yáng)性；產(chǎn)H2S陽(yáng)性，V-P實(shí)驗(yàn)陰性；37 ℃加熱能存活，能運(yùn)動(dòng)；文獻(xiàn)[10]表明微桿菌屬僅有31 種，而高艷秀等[11]研究結(jié)果報(bào)道微桿菌屬共有34 個(gè)種，另外3 個(gè)種分別為M. paraoxydans、M. aerolatum、M. gubbeenense，因M. paraoxydans產(chǎn)H2S陰性[12]，M. aerolatum不能利用L-阿拉伯糖[13]，M. gubbeenense不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、蔗糖產(chǎn)酸[14]，不同于本研究的菌株YD01生理生化特征。通過(guò)BLAST程序比對(duì)后，顯示同源性較高的菌株中并無(wú)M.imperial，而同源性高的M. trichothecerolyticum則在37 ℃下不能存活、不能利用阿拉伯糖、不能運(yùn)動(dòng)，M. hominis則不能利用木糖、不能運(yùn)動(dòng)，與生理生化特征鑒定結(jié)果相悖。可見(jiàn)16S rRNA序列同源性分析結(jié)果與生理生化鑒定結(jié)果存在部分差異，尚不能十分準(zhǔn)確地將YD01菌鑒定至種，于是本研究結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定該菌株為微桿菌屬蛾微桿菌M. imperiale。

我國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可用于面粉面食的酶制劑有淀粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶等[15]。實(shí)驗(yàn)證明，在面粉中添加木聚糖酶，能使不溶性阿拉伯木聚糖增溶，改進(jìn)面團(tuán)的機(jī)械強(qiáng)度和增加面包的體積，改進(jìn)面包的色澤。我國(guó)成功研發(fā)了內(nèi)切木聚糖酶，它可以使阿拉伯木聚糖水解成為水溶性的寡糖，其水解率達(dá)65%，產(chǎn)生以木二糖、木三糖為主的低聚糖混合物。這種低聚木糖甜味純正，耐高溫不分解，pH值穩(wěn)定性好，有利于雙歧桿菌增殖，對(duì)改善腸道功能增進(jìn)健康有明顯效果。假如面粉中阿拉伯木聚糖為2%，其中有1.5%的不溶性阿拉伯木聚糖，經(jīng)內(nèi)切木聚糖酶水解50%，則有0.75%的低聚木糖。即每100 g的面食中，就有0.75 g的低聚木糖，這正好是攝入的有效劑量。這樣就做到了以主食為載體的低聚木糖功能食品。Chapla等[16]使用來(lái)自臭曲霉MTCC 4898的部分純化的木聚糖酶進(jìn)行選擇性生產(chǎn)低聚木糖。在45 ℃下用20 U木聚糖酶的反應(yīng)8 h后，木寡糖的最大產(chǎn)量為（6.73±0.23） mg/mL。Rajagopalan等[17]利用梭菌BOH3純化的木聚糖酶從堿預(yù)處理的紅木和芒果木屑中生產(chǎn)益生元-低聚木糖。Nieto-Domínguez等[18]研究了新型真菌GH11木聚糖酶對(duì)樺木木聚糖制備的低聚木糖的益生元效應(yīng)，通過(guò)分析母乳喂養(yǎng)兒童糞便發(fā)酵中微生物組成和有機(jī)酸分布的變化，即乙酸和乳酸的驟增，潛在致病菌的減少和雙歧桿菌的增加，以及可能的有益共生物，證實(shí)了這些低聚木糖的益生元價(jià)值。Jagtap等[19]使用來(lái)自農(nóng)業(yè)廢棄物的粗微生物酶生產(chǎn)低聚木糖，無(wú)需預(yù)處理，在12 h后獲得1%的低聚木糖并且可能作為營(yíng)養(yǎng)保健品應(yīng)用。木聚糖酶在眾多領(lǐng)域充分顯示了它廣闊的應(yīng)用前景，但由于存在著經(jīng)濟(jì)性、穩(wěn)定性、使用效率等各方面的問(wèn)題，木聚糖酶大規(guī)模投入工業(yè)應(yīng)用還有待努力。目前國(guó)內(nèi)外很多研究團(tuán)隊(duì)篩選到一些產(chǎn)酶微生物。包怡紅等[20]以木聚糖為唯一碳源，從富含半纖維素的土壤生境采樣，分離、純化、酶活測(cè)定后，經(jīng)16S rRNA鑒定其為類芽孢桿菌，最適pH值為5，最適溫度為50 ℃；梁芳芳等[21]經(jīng)富集培養(yǎng)與透明平板篩選的方法得到透明圈最大的木聚糖酶產(chǎn)生菌X7，經(jīng)鑒定其為枯草芽孢桿菌，最適pH值為6，最適溫度為55 ℃；騰超等[22]從土樣中篩選得到高產(chǎn)木聚糖酶霉菌，經(jīng)菌體形態(tài)觀察、菌落培養(yǎng)特征與18S rRNA序列同源性比對(duì)等分析，鑒定該菌為嗜熱踝節(jié)菌；李里特等[23]以木聚糖為唯一碳源篩選出1 株木聚糖酶高產(chǎn)菌株，經(jīng)菌落特征、生理生化特征和細(xì)胞壁化學(xué)組分分析等試驗(yàn)鑒定該菌為卷須鏈霉菌，最適pH值為6.0；He Haiyan等[24]利用甘蔗渣為底物培養(yǎng)米曲霉HML366所產(chǎn)木聚糖酶的最適溫度為65 ℃，最適pH值為6.0；Mander等[25]以麥麩為底物培養(yǎng)鏈霉菌屬CS624所產(chǎn)木聚糖酶最適溫度為60 ℃，最適pH值為6.0；Walia等[26]發(fā)現(xiàn)纖維化纖維微細(xì)菌所產(chǎn)木聚糖酶最適溫度為55 ℃，最適pH值為8.0。Wu He等[27]以甘蔗渣半纖維素為碳源，通過(guò)灰色鏈霉菌LH-3產(chǎn)生的胞外熱穩(wěn)定木聚糖酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，最適pH值為5.0，最適溫度60 ℃時(shí)表現(xiàn)出最大的活性。

但這些菌株所產(chǎn)的木聚糖酶仍然存在缺陷，不能大規(guī)模應(yīng)用于生產(chǎn)。要著力研發(fā)耐酸堿性、熱穩(wěn)定性好的木聚糖酶。本次鑒定出產(chǎn)堿性木聚糖酶細(xì)菌——蛾微桿菌M. imperiale，還鮮見(jiàn)報(bào)道，菌株YD01所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值為8.0，最適溫度為50 ℃；在pH 10時(shí)，仍有87%剩余酶活力，在80 ℃時(shí)，亦可達(dá)85%剩余酶活力，具有較好的耐堿性及熱穩(wěn)定性，有運(yùn)用到工業(yè)生產(chǎn)的潛力。

對(duì)木聚糖酶基因進(jìn)行定點(diǎn)突變和固定化等方法來(lái)改善木聚糖酶學(xué)性質(zhì)，使木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)滿足應(yīng)用需求[2]。Li Fei等[28]對(duì)來(lái)自黑曲霉的木聚糖酶基因進(jìn)行堿性pH值定點(diǎn)突變改造，突變體XynB-117，與野生型酶相比，提高了相當(dāng)于初始的0.5 個(gè)pH值單位。Ribeiro等[29]將木聚糖酶插入到木糖結(jié)合蛋白中，發(fā)現(xiàn)有木糖存在時(shí)，酶活性提高了20%，原始的酶活性則被抑制。李同彪等[30]通過(guò)在黑曲霉木聚糖酶Xyn ZF-2α-螺旋催化活性中心位點(diǎn)處引入疏水性氨基酸，從而使酶的熱穩(wěn)定性大幅提高。Wickramasinghe等[31]通過(guò)對(duì)從局部分離的木霉屬物種克隆EXNI基因進(jìn)行克隆和異源胞外表達(dá)，從而基因修飾樹干畢赤酵母菌（Pichia stipitis），將木聚糖水解成木寡糖。使用pGAPZα表達(dá)載體將樹干畢赤酵母工程化以攜帶Trichoderma virens的EXNI基因。本研究有助于挖掘我國(guó)堿性木聚糖酶細(xì)菌資源，為進(jìn)一步構(gòu)建工程菌提高木聚糖酶表達(dá)水平以及利用定點(diǎn)突變技術(shù)改善酶學(xué)性質(zhì)提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

以木聚糖為唯一碳源，從造紙廠活性污泥中篩選1 株高產(chǎn)堿性木聚糖酶細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)，生理、生化特征以及序列分析鑒定為微桿菌屬蛾微桿菌（M. imperiale）。酶學(xué)性質(zhì)表明，該菌株所產(chǎn)木聚糖酶的最適pH值為8.0，最適溫度為50 ℃；在pH 10時(shí)，仍有87%剩余酶活力，在80 ℃時(shí)，亦可達(dá)85%剩余酶活力，具有較好的堿耐受性及熱穩(wěn)定性，最終發(fā)酵產(chǎn)酶水平為36.85 U/mL。