不同茶樹品種懸浮發酵對茶黃素形成的影響

江用文，滑金杰，袁海波，馬海樂*

（1.江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇 鎮江 212013；2.中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008）

茶黃素是多酚類（兒茶素類）在酶源和濕熱作用下氧化縮合形成的一類溶于乙酸乙酯的、具有苯并卓酚酮結構的化合物，是組成紅茶鮮爽度和強度等滋味的重要成分，同時是形成紅茶茶湯“黃金圈”的主要物質[1-4]，同時茶黃素具有防癌抗癌、抗菌、抗氧化等多方面的保健價值[5-10]。近年來，隨著對茶黃素功能活性的不斷探究，學者不僅通過工藝和品種的改良獲得高茶黃素的紅茶，還通過葉外懸浮/液體發酵獲得高茶黃素的提取液。現有有關懸浮發酵對茶黃素形成影響的研究多集中在外源因素，如發酵溫度[11-13]、pH值[14]、通氧量[15-16]、時間[17-18]等，夏濤等[13,19-21]較系統地研究了鮮葉勻漿懸浮發酵，明確適度萎凋的鮮葉進行懸浮發酵更有利于茶黃素的生成，獲得影響懸浮發酵的關鍵因子（濃度、pH值等），并得到了優化的懸浮發酵工藝參數。而內源因素，如鮮葉品種、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）酶源組合和配比、兒茶素底物組成和含量、酶源與底物共同作用等，對茶黃素形成能力和形成量影響的研究較少；僅獲得表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）與茶黃素的形成具有明顯的相關性[22]，PPO和POD對氧化兒茶素具有競爭性[23-24]等初步結果，而酶源活性和組合及兒茶素組分對茶黃素組分形成影響的研究缺乏。為此篩選酶源組成和兒茶素組成配比差異較大的、且實際紅茶產區中應用較廣泛的福鼎大白、英紅9號、櫧葉齊、金觀音等品種原料進行懸浮發酵實驗，探究PPO和POD酶源活性和配比、兒茶素組分（簡單兒茶素和酯型兒茶素）配比和濃度等對茶黃素形成能力的影響，為茶黃素的合成理論和茶鮮葉的綜合利用奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

鮮葉品種及產地：福鼎大白茶 杭州茶葉試驗場；櫧葉齊 湖南省農業科學院茶葉研究所；英紅9號 廣東省農業科學院茶葉研究所；金觀音 福建省農業科學院茶葉研究所。等級：一芽一葉至一芽二葉初展。采摘時間：2016年5月初。

1.2 儀器與設備

FTE-BTD真空冷凍干燥機 美國Kinetic公司；pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-3600紫外-可見近紅外分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司；BT 124s分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；5810R臺式高速大容量離心機 德國艾本德公司；T18高速分散機 德國IKA集團；PLTW-BA型水浴恒溫振蕩器 寧波普朗特儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣液制備

參照前人的研究[18,25]，分別取100 g預萎凋的福鼎大白、英紅9號、櫧葉齊、金觀音等品種鮮葉，作為不同酶源（PPO、POD等）活性和配比，以及不同兒茶素組分配比的來源，加入1 000 mL濃度0.02 mol/L pH 5.6預冷的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，在高速分散機內勻漿1 min，至葉組織粉碎均勻，置于2 000 mL收集瓶內，置于恒溫水浴振蕩器，調控水浴溫度35 ℃、通氧量0.8 L/min、振蕩速率150 r/min等參數，開始進行懸浮發酵，分別在發酵0、15、30、45、60、75、90、120 min等時間點進行8 點取樣，均勻取樣9 mL，加入1 mL飽和檸檬酸終止氧化反應，迅速離心（4 ℃、9 000 r/min離心10 min），過膜待測。

1.3.2 酶活性與成分檢測

PPO活性采用鄰苯二酚比色法[26]進行測定；POD活性采用愈創木酚比色法[26]進行測定。兒茶素組分和茶黃素組分利用高效液相色譜法[27]進行檢測。

1.4 數據處理

每個處理檢測結果進行3 次重復，以平 ±s顯示。采用SAS 9.1軟件進行實驗數據分析，處理間平均值的比較用最小顯著差異法。

2 結果與分析

2.1 不同品種鮮葉PPO活性、POD活性和PPO活性/POD活性比值的比較

PPO和POD是催化兒茶素組分氧化，轉化形成茶黃素、茶紅素等物質的關鍵酶類，但兩者催化兒茶素反應的方向不同，且存在競爭性[28-30]。對4 個品種的2 種酶活性進行比較，PPO活性以福鼎大白和金觀音品種顯著高于其他2 個品種，均達到1.60 U/g以上，英紅9號次之，櫧葉齊顯著最低；POD活性以金觀音和櫧葉齊品種顯著高于其他2 個品種，均達到23.0 U/g以上，英紅9號次之，福鼎大白顯著最低；綜合指標PPO活性/POD活性比值（簡寫為PPO/POD值）以福鼎大白品種顯著最高，達到0.094，英紅9號和金觀音品種次之，櫧葉齊品種顯著最小，僅0.042。

表1 不同品種鮮葉PPO和POD活性Table 1 Activities of PPO and POD from fresh leaves of different cultivars

2.2 不同品種鮮葉酶源對懸浮發酵下簡單兒茶素組分和總量變化規律的影響

不同品種GC、EGC、兒茶素（catechin，C）、EC等4 種簡單兒茶素及其總量在懸浮發酵過程中的變化如圖1所示。不同組分在鮮葉的簡單兒茶素總量（total simple catechin，TSC）中的占比不同，其中以EGC顯著最高（圖1B），均值達到0.330 mg/mL（P＜0.05），大幅度高于其他3 組分，EC次之（圖1D），GC相對最低（圖1A），僅0.056 mg/mL。不同品種茶鮮葉不同TSC組分差異較大，其中EGC、C和EC組分以英紅9號最高，GC以金觀音品種最高，櫧葉齊品種則在GC和EGC組分最低，不足英紅9號品種的50%。

懸浮發酵過程中，除金觀音和福鼎大白的C組分在懸浮發酵前15 min略有增加（圖1C），分析原因在于酯型兒茶素轉化形成茶黃素的同時裂解形成小分子的C組分所致；其他品種的其他組分均不同程度地下降，且均在前30 min呈現大幅度減少，減少量均在75%以上，即發酵前30 min簡單兒茶素組分呈現劇烈的酶促氧化反應，至發酵45 min，消耗量達90.0%以上，簡單兒茶素組分所剩無幾，4 種組分均在0.010 mg/mL以下。

圖1E為不同品種的TSC在懸浮發酵下的變化規律。從鮮葉來看，英紅9號的TSC顯著最高（P＜0.05），達0.809 mg/mL，金觀音略高于福鼎大白，櫧葉齊最低，僅0.533 mg/mL；TSC前45 min呈勻速大幅度下降的趨勢，總消耗量以英紅9號最大，達0.783 mg/mL，顯著高于（P＜0.05）其他3 品種鮮葉，金觀音次之，福鼎大白顯著最低，僅0.520 mg/mL。45 min后，各品種TSC均在0.035 mg/mL以下，含量趨于平穩。即不同品種間，以英紅9號的TSC消耗量最大，金觀音次之，櫧葉齊最低。

圖1 不同品種鮮葉懸浮發酵過程中4 種簡單兒茶素組分含量的變化Fig. 1 Variations in 4 simple catechins during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

2.3 不同品種鮮葉酶源對懸浮發酵下酯型兒茶素組分和總量變化規律的影響

不同品種EGCG、GCG、ECG、CG等4 種酯型兒茶素組分懸浮發酵過程中的變化規律如圖2所示。4 組分在茶鮮葉中酯型兒茶素總量（total ester-type catechin，TETC）的占比不同，以EGCG相對最高，均值達到0.531 mg/mL（圖2A），顯著高于（P＜0.05）其他3 個組分總和（0.245 mg/mL），ECG次之，CG相對最低，僅0.005 mg/mL（圖2D）。不同品種茶鮮葉的不同TETC差異顯著，如EGCG、ECG和CG組分以英紅9號顯著最高（P＜0.05），以櫧葉齊顯著最低，而GCG組分則以櫧葉齊品種最高，英紅9號最低。

不同TETC在懸浮發酵中變化規律不同，其中EGCG和ECG組分呈前45 min迅速消耗（圖2A和圖2C）而后平穩的趨勢，前30 min消耗量最大，達70%以上，至45 min，各品種EGCG質量濃度均在0.05 mg/mL以下，ECG質量濃度均在0.015 mg/mL以下，消耗量在90%以上；不同品種比較，福鼎大白和金觀音的EGCG和ECG消耗量顯著大于英紅9號和櫧葉齊品種，前2 個品種的EGCG組分在發酵30 min時質量濃度在0.04 mg/mL以下，而英紅9號和櫧葉齊EGCG保留量均高于0.10 mg/mL。GCG組分除櫧葉齊呈逐漸下降的趨勢，其他3 品種呈先升后降的趨勢，峰值點出現在15～30 min，以金觀音增長相對最多，后迅速消耗；CG組分總體呈前期略有上升后期平穩的趨勢，其中以英紅9號顯著最高（P＜0.05），櫧葉齊次之，福鼎大白相對最低。

圖2 不同品種鮮葉懸浮發酵過程中4 種酯型兒茶素組分的變化Fig. 2 Variations in 4 catechin esters during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

圖2E是不同品種的TETC在懸浮發酵過程中的變化，從鮮葉來看，英紅9號顯著最高（P＜0.05），達0.872 mg/mL，福鼎大白略高于金觀音，櫧葉齊最低，僅0.697 mg/mL。整個發酵進程中前30 min TETC消耗最快，不同品種相比以英紅9號和櫧葉齊仍有部分保留（保留量0.190 mg/mL以上），這與較低活性的PPO相關，而具有高PPO活性的福鼎大白和金觀音品種在發酵30 min后TETC均低于0.080 mg/mL，氧化消耗率均在90.0%以上。而后在發酵45 min后緩慢趨于穩定，各品種TETC差異不顯著。整體上，以英紅9號的TETC消耗量最大，達0.842 mg/mL，金觀音次之，櫧葉齊相對最低，僅0.650 mg/mL。

圖3 不同品種鮮葉懸浮發酵過程中TAC的變化Fig. 3 Variations in total amount of catechins during suspended fermentation during fresh leaves of different cultivars

懸浮發酵過程中不同品種8 種兒茶素總量（total amount of catechins，TAC）的變化規律如圖3所示。以英紅9號鮮葉TAC顯著最高（P＜0.05），達1.680 mg/mL，金觀音和福鼎大白次之，兩者相差不大，但以福鼎大白品種的TETC相對較高，金觀音品種的TSC相對較高，櫧葉齊相對最低，僅1.230 mg/mL。4 個品種TAC整體呈前30 min迅速下降的趨勢，平均下降速率以金觀音最大，達0.042 mg/（mL·min），福鼎大白次之，櫧葉齊顯著最低，僅0.030 mg/（mL·min）。發酵30～45 min間TAC在PPO和POD作用下進一步消耗，降至在0.095 mg/mL以下，45 min后含量趨于平穩。整體上，以英紅9號的TAC消耗量最大，達1.639 mg/mL，金觀音次之，櫧葉齊相對最低，僅1.192 mg/mL。

2.4 不同品種鮮葉酶源和底物對懸浮發酵下茶黃素組分及總量形成規律的影響

不同品種的茶黃素（theaflavin，TF）、茶黃素-3-沒食子酸酯（theaflavin 3-gallate，TF-3-G）、茶黃素-3’-沒食子酸酯（theaflavin 3’-gallate，TF-3’-G）、茶黃素雙沒食子酸酯（theaflavin 3,3’-digallate，TF-D-G）4 種茶黃素組分在懸浮發酵過程中的生成變化規律如圖4所示。不同品種各茶黃素組分均隨著發酵時間延長呈現先增后降的趨勢，然而不同品種茶黃素組分峰值點出現的時間不同，英紅9號和櫧葉齊在發酵30 min達到峰值，而福鼎大白和金觀音品種的PPO活性顯著較高（表1），故可以較快將兒茶素組分轉化形成茶黃素，在發酵15 min即達到峰值，而后隨著兒茶素組分消耗過快，茶黃素各組分含量逐漸下降。不同品種不同茶黃素組分的峰值差異顯著，TF組分（圖4A）以英紅9號顯著最高（P＜0.05），達0.089 mg/mL，金觀音次之（0.046 mg/mL），櫧葉齊最低，僅0.022 mg/mL；TF-3-G組分含量在發酵15min時呈福鼎大白＞金觀音＞英紅9號＞櫧葉齊（圖4B）趨勢，原因在于發酵15 min時TF-3-G組分的合成前體EGCG組分以福鼎大白品種消耗量最大（圖2A），在高PPO活性催化下達0.290 mg/mL，金觀音次之（0.244 mg/mL），櫧葉齊顯著最低（P＜0.05），僅0.127 mg/mL，然進一步發酵金觀音和福鼎大白品種TF-3-G組分的轉化量大于生成量開始下降，而英紅9號和櫧葉齊品種兒茶素在低活性PPO作用下持續氧化轉化，加上具有較高含量的底物（圖2A），故峰值高于福鼎大白品種，且TF-3-G峰值英紅9號品種大于櫧葉齊品種；TF-3’-G組分峰值點呈現英紅9號＞金觀音＞櫧葉齊＞福鼎大白的特點。TF-D-G組分峰值以福鼎大白品種顯著最高，英紅9號品種底物更多地用于TF-3-G組分的形成，故TF-D-G組分峰值低于福鼎大白品種，然而高組分的兒茶素底物保證了英紅9號品種的4 個茶黃素組分在30 min以后的發酵時間里均顯著高于其他3 個品種，而櫧葉齊品種雖兒茶素底物含量較低，但PPO和POD活性亦較低，故茶黃素組分轉化成茶紅素、茶褐素等能力差，故在TF、TF-3-G、TF-D-G等組分含量在發酵60 min以后高于金觀音和福鼎大白品種。

圖4 不同品種鮮葉懸浮發酵過程中4 種茶黃素組分含量和總量的變化Fig. 4 Variations in the contents of four theaf l avins during suspended fermentation of fresh leaves of different cultivars

不同品種4種茶黃素總量隨著發酵時間的變化規律如圖4E所示。因高活性PPO、發酵前15 min較高消耗量的EGC、EGCG、ECG等組分，導致金觀音和福鼎大白品種在發酵15 min時茶黃素總量出現峰值，且金觀音品種略高于英紅9號品種。而較低活性的PPO和POD（表1）可持續氧化最高兒茶素底物含量的英紅9號品種，可實現茶黃素的持續生成，在30 min達到峰值，為0.226 mg/mL，極顯著高于其他品種（P＜0.01），并且直至120 min發酵結束，仍顯著最高（P＜0.05）。櫧葉齊品種則因相對最低活性的PPO（1.004 U/g），以及相對最低含量的兒茶素底物（圖3），茶黃素總量峰值顯著最低，然而較低活性的POD可減少TFS的再轉化，故發酵60 min后櫧葉齊茶黃素總量略高于福鼎大白和金觀音品種。

從總體上看，不同茶樹品種，對應的兒茶素底物濃度和組分比例以及酶源活性和配比顯著不同，進而直接影響茶黃素的生成速率和生成量，具有顯著最高TAC的英紅9號品種可產生顯著最多的茶黃素（P＜0.05）；福鼎大白和金觀音品種的TAC相近，然而組成不同，其中以福鼎大白TETC/TSC相對較高，且PPO/POD值顯著高于金觀音品種（P＜0.05），故福鼎大白品種可產生第2高的茶黃素，但TAC顯著低于英紅9號，故茶黃素形成能力略差于英紅9號，而TAC含量和PPO/POD值顯著最低的櫧葉齊品種，茶黃素的形成速率和形成量顯著最低（P＜0.05）。

3 結 論

4 個品種鮮葉PPO活性、POD活性、PPO/POD值差異顯著，其中PPO活性以福鼎大白品種顯著最高，以櫧葉齊品種顯著最低；POD活性以櫧葉齊品種最高，福鼎大白品種顯著最低；PPO/POD值以福鼎大白最高，英紅9號次之。

不同品種的簡單兒茶素組分以EGC含量最高，EC次之；酯型兒茶素組分以EGCG含量最高，ECG次之；酯型兒茶素的鮮葉原始量和氧化消耗量均大于簡單兒茶素，TSC和TETC均以英紅9號顯著最高，櫧葉齊顯著最低；兒茶素各組分除GCG和CG外均呈前期劇烈消耗下降，后期平穩的趨勢，巨降期均在發酵前30 min。

不同品種的不同茶黃素組分形成能力和形成量差異顯著，各茶黃素組分均呈先升后降的趨勢，但峰值點時間和峰高不同，其中英紅9號和櫧葉齊各茶黃素總量組分峰值點均為發酵30 min，福鼎大白和金觀音品種則為15 min，茶黃素總量以英紅9號最大，福鼎大白和金觀音次之，櫧葉齊顯著最低。

PPO/POD值和兒茶素含量及配比兩者對茶黃素的形成具有同等關鍵作用，高兒茶素底物含量的同時，需配有對應高PPO活性和PPO/POD值，才能快速高效地形成茶黃素，同時減少茶黃素的進一步轉化，保持高茶黃素的形成，同等兒茶素含量以TETC/TSC值較高者，即酯型兒茶素含量較高，更有利于茶黃素的形成。