花青素對大豆蛋白體外胃消化結構的影響

江連洲，李佳妮，鄒曉霜，胡 淼，賈子璇，王中江，齊寶坤，李 楊，隋曉楠*

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

大豆蛋白是一種優質植物蛋白，屬全價蛋白，富含近20 種氨基酸，是人類生存不可或缺的重要蛋白來源[1]，8 種必需氨基酸含量高于聯合國糧食及農業組織及世界衛生組織推薦比例，不含膽固醇，消化率及功效比近乎等同于動物蛋白[2-3]。大豆蛋白主要由β-伴大豆球蛋白及大豆球蛋白構成[3]，β-伴球蛋白即7S球蛋白（180～210 kDa），主成分為α、α’及β亞基[4]。免疫印跡實驗表明，7S球蛋白中α-亞基為引起機體過敏的主要致敏原，極易被過敏性皮炎病患的血清IgE抗體識別[5]。大豆球蛋白即11S球蛋白（340～375 kDa），主要由酸性及堿性亞基通過二硫鍵連接而成。其中，由于大豆分離蛋白（soybean protein isolates，SPI）具有蛋白含量高、功能特性突出等優點而成為食品工業生產中應用最多的一種大豆蛋白。SPI為氨基酸間相聯結形成的具特定空間結構的生物大分子，分子構造較緊密，對酶解作用也有較強抗力[6]。

花青素為植物次生代謝產物，屬類黃酮化合物，其基本結構為3,5,7-羥基-2-苯基苯并吡喃，大多數花青素在花色基元的3,5,7-碳位上有取代羥基[7]。花青素具有與蛋白質選擇性結合的能力，包括氫鍵作用、疏水作用及靜電吸附等。氫鍵的形成主要是通過花青素結構中的氫原子與蛋白質中的電負性離子結合；同時花青素中含疏水性基團，蛋白中存在疏水性氨基酸，因而兩者也可通過疏水作用結合，花青素對蛋白的結合作用能夠在一定程度改變蛋白結構功能及消化性等[8-9]。花青素在生理學中扮演重要角色，有助于預防多種疾病：包括癌癥[10-11]、心臟病、關節炎和心血管疾病[12]等，同時具有抗炎與增強免疫力等高效生物活性[13]。

日常飲食中，大豆蛋白會同某些食物組分發生相互作用，從而影響蛋白的結構、營養、功能及消化特性等。經研究積累，現已對部分食用蛋白的酶降解情況、生物利用率有了較充分的認知，但對其在機體消化道環境中的消化情況卻知之甚少，對蛋白在多食物組分體系影響下的消化特性研究更為匱乏。蛋白質對機體生命活動意義重大，其被消化吸收的程度，是衡量其營養價值的重要前提，因此從營養及經濟學角度而言，明晰蛋白同其他食物組分互作對蛋白消化特性的影響具有重要意義[14]。

本實驗將SPI與花青素以不同質量配比，采用體外消化模型模擬蛋白體外消化過程，通過研究各樣品中蛋白水解率、結構、亞基組成及分子質量分布差異，闡明花青素添加量對蛋白消化特性及體外消化結構的影響。本實驗通過深入探究機體在多食物組分下對蛋白消化、吸收的程度，全面深入評價及建立大豆蛋白營養消化模式，旨在為食品生產加工領域制備易消化、高吸收、低致敏的優質蛋白產品及營養膳食搭配方式提供理論指導，進而促進大豆蛋白產業發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆 市售；黑米提取物 中國山西天之潤生物科技有限公司；胃蛋白酶（3 250 U/mg） 美國Sigma公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑盒 中國Solarbio公司；甲酸、乙腈（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、乙酸乙酯、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、氯化鈉、六水氯化鎂、碳酸銨、氯化鈣、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

GL-25MS超速高速冷凍離心機 上海盛析儀器設備有限公司；FD5-3型冷凍干燥機 美國SIM公司；固相萃取裝置 上海興納生物科技有限公司；旋轉蒸發儀 上海恬恒儀器有限公司；WAT023635高效液相色譜儀、C18反向色譜柱（250 mm×4.6 mm，Sunfire）美國Waters公司；排阻色譜柱（300 mm×4.6 mm，Wilmington） 美國安捷倫科技有限公司；恒溫水浴振蕩搖床 常州恩培儀器制造有限公司；GelDoc XR System凝膠成像系統 美國伯樂公司；J-810圓二色譜儀 日本Jasco公司；F-4500型熒光光譜儀 日本Hitachi公司；PHS-25型酸度計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI制備

參照Petruccelli等[15]的方法。大豆去皮粉碎，過60 目篩網后與正己烷1∶3（g/mL）比例混合脫脂，重復3 次，即得脫脂豆粉。將脫脂豆粉與水以1∶20（g/mL）比例混合，用2 mol/L NaOH溶液調pH 8.0，室溫下充分攪拌2 h。攪拌后懸濁液于4 ℃、14 000×g離心20 min取上清液。用2 mol/L HCl溶液調節上清液pH 4.5，靜置溶液2 h后以6 000×g離心20 min，取離心后沉淀用蒸餾水充分水洗3 次后，用2 mol/L NaOH溶液調節pH 7.0，樣品-40 ℃預凍24 h后冷凍干燥，研磨即得SPI。

1.3.2 固相萃取提純花青素

固相萃取提純黑米提取物中花青素步驟參照Rodriguez-Saona等[16]的方法。將黑米提取物溶于去離子水后，減壓抽濾。隨后將濾液通過固相萃取柱使花青素被完全吸附，用5 倍柱體積0.01% HCl溶液洗脫樣品中不溶性成分，如糖、酸等，隨后用3 倍柱體積的乙酸乙酯溶液洗脫樣品中除花青素外的多酚類雜質，如酚酸、黃酮等，最后用4 倍柱體積甲醇溶液洗脫吸附于柱上的花青素。采用旋轉蒸發去除甲醇得到花青素提純樣品，溶于酸性水溶液中冷凍保存，采用高效液相色譜法確定純化后花青素質量濃度及純度。

1.3.3 花青素定量分析標準曲線繪制

準確量取矢車菊素-3-葡萄糖苷標品，將其溶解至1%鹽酸甲醇溶液內，并經不同比例稀釋成質量濃度分別為0.000 1、0.001、0.025、0.05、0.1 mg/mL的標液，將各質量濃度標液過0.45 μm濾膜，采用高效液相色譜進樣分析，以各標液質量濃度為縱坐標，對應的峰面積為橫坐標繪制標準曲線：y＝1.32×10-8x-5.414×10-4，R2=0.997 8。線性回歸分析表明，質量濃度與峰面積在0.000 1～0.1 mg/mL內有良好線性關系[17]。

1.3.4 高效液相色譜法定量花青素質量濃度

取純化的花青素提取物過0.45 μm濾膜，利用C18色譜柱及高效液相色譜設備進行分析。流速1 mL/min，柱箱溫度25 ℃，流動相A為5%甲酸，流動相B為100%乙腈。梯度洗脫：0～5 min 100% A； 20 min 90% A；40 min 87% A；44 min 80% A；50 min 75% A；55 min 0% A。進樣量50 μL，檢測器波長520 nm[18]。

1.3.5 SPI-花青素復合體系制備

依照Nagy等[19]研究方法稍作修改。將SPI充分溶解至0.01 mol/L磷酸緩沖液中（pH 7.4）配制成50 mg/mL SPI溶液，并將花青素按一定比例溶解于SPI溶液中，使花青素最終質量濃度分別為0.5、1 mg/mL和2.5 mg/mL。按一定質量比溶解于SPI溶液并于室溫下混合攪拌2 h制成SPI-花青素復合體系。

1.3.6 體外模擬消化

體外模擬消化參考Minekus等[20]方法并稍作修改。將50 mL待消化樣品混于37.5 mL模擬胃環境的電解質溶液中（含6.9 mmol/L KCl、0.9 mmol/L KH2PO4、25 mmol/L NaHCO3、47.2 mmol/L NaCl、0.1 mmol/L MgCl2(H2O)6、0.5 mmol/L (NH4)2CO3），并于電解液中加入25 μL 0.3 mol/L CaCl2溶液，精密量取一定體積1 mol/L HCl溶液調節混合液pH 2.3，并記錄鹽酸用量V（HCl），隨后加入（4.475-V（HCl））mL蒸餾水，最后加入8 mL胃蛋白酶（25 000 U/mL），使最終消化液中蛋白酶達2 000 U/mL，上述樣品及試劑在混合前均需在37 ℃條件下預熱30 min。將配制好的混合液置于37 ℃水浴振蕩搖床中進行胃部消化反應1.5 h，并實時監控pH值恒定。體外消化過程中，分別于第0、5、15、30、45、60、90分鐘處進行抽樣檢測以探究消化產物的結構特征及蛋白解離機制，各消化終點處采用0.5 mol/L NaHCO3將消化液pH 7.0終止反應。消化液高速離心去除不溶性蛋白沉淀，取上清液，冷凍干燥，備用。

1.3.7 蛋白水解度測定

采用TCA沉淀法測定蛋白水解度。TCA屬于典型蛋白沉淀劑之一，能夠使大分子蛋白及較大肽段沉淀。隨消化進行，蛋白的肽鏈被蛋白酶水解成大小不等的片段，此時在TCA中溶解指數增大。針對特定反應底物而言，TCA能夠定性反映出蛋白水解程度，其溶解指數越大，代表被水解生成的短肽鏈越多。本實驗以TCA可溶解性氮含量表征蛋白水解度，在各消化取樣點處取消化液適量，隨后立即與等體積10% TCA溶液混合以沉淀未消化的大分子質量蛋白。混合液靜置10 min后于8 000×g離心15 min。采用微量凱氏定氮（N×6.25）測定沉淀及其他蛋白樣品對應的氮含量。蛋白質水解度計算公式如下[21]：

式中：DH為水解度/%；N0為消化前蛋白樣品中TCA-沉淀氮含量/mg；Nt為消化t min后TCA-沉淀氮含量/mg；Ntot為蛋白樣品中總氮含量/mg。

1.3.8 蛋白質亞基組成的測定

參考Laemmli等[22]的方法并稍加修改。將20 μL樣品稀釋后置于含β-巰基乙醇的2×上樣緩沖液中，并于95 ℃加熱90 s做變性處理。分別配制15%分離膠與5%濃縮膠，上樣量為10 μL，電泳過程電壓恒定，濃縮膠電壓60 V，分離膠電壓120 V。染色劑為0.25 g/L考馬斯亮藍R-250（0.25 g考馬斯亮藍R-250，400 mL甲醇、70 mL冰乙酸定容至1 L），電極液為14.41 g甘氨酸、3.03 g Tris、1.0 g SDS定容至1 L，脫色液A為甲醇-冰乙酸-水（40∶7∶53，V/V），脫色液B為甲醇-冰乙酸-水（5∶7∶88，V/V）。電泳膠片采用GelDoc XR System凝膠成像系統進行拍照分析。

1.3.9 體外模擬消化產物分子質量分布分析

利用體積排阻色譜-高效液相色譜法測定水解蛋白肽的分子質量分布。將經胃蛋白酶水解的蛋白離心分離取上清液，稀釋后過0.45 μm濾膜。排阻色譜柱（300 mm×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：150 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；樣品進樣量10 μL，流動相流速0.3 mL/min，紫外檢測波長220 nm，柱溫25 ℃，運行樣品30 min。相對分子質量校正曲線所用標準品：牛血清白蛋白（67 000 Da）、雞白蛋白（44 000 Da）、核糖核酸酶（13 700 Da）、胰島素（5 500 Da）、VB12（1 350 Da）。

1.3.10 蛋白空間構象測定

1.3.10.1 圓二色譜分析

以圓二色譜法測定樣品中蛋白二級結構變化，將樣品溶于0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）中稀釋，使蛋白質量濃度為0.5 mg/mL。25 ℃、以100 nm/min掃描速率在190～260 nm范圍內掃描，樣品池光程1 mm，分辨率0.1 nm。采用“CDPro”曲線擬合軟件對數據處理分析求得二級結構含量，每組樣品重復測定3 次。

1.3.10.2 熒光光譜分析

參考江連洲等[23]方法并稍作修改。待測樣品用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）稀釋，使樣品蛋白質量濃度達到0.25 mg/mL[24]。熒光發射光譜分析時采用蛋白分子內色氨酸熒光基團作探針，激發波長290 nm，測定波長范圍為300～450 nm，掃描速率240 nm/s，激發條帶寬度10 nm，激發和發射狹縫均10 nm，每組樣品重復測定3 次。

1.4 數據統計與分析

每組實驗均重復3 次，結果表示為 ±s，使用Statistics 8進行ANOVA差異顯著性分析（P＜0.05為顯著性差異）。采用Origin 8.5等軟件對數據、圖表進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 純化花青素質量濃度確定

圖1 純化花青素色譜圖Fig. 1 Chromatogram of purified anthocyanin

如圖1所示，黑米提取物中花青素主成分為矢車菊素-3-葡萄糖苷，為方便計算，將矢車菊素-3-葡萄糖苷質量濃度視為花青素質量濃度做近似處理。根據標準曲線計算最終花青素純度為（91.23±0.02）%，可認為純品，相對分子質量按449.38計算。矢車菊素-3-葡萄糖苷峰[25]的保留時間為25.799 min，將該峰面積3 128 521代入標曲求得純化后花青素質量濃度約為50 mg/mL。

2.2 SPI體外消化水解度

圖2 添加不同質量花青素后SPI體外消化水解度Fig. 2 Change in TCA solbule nitrogen content during in vitro digestion of SPI with different concentrations of anthocyanin added

模擬胃液消化過程中，蛋白多肽被逐漸水解，蛋白水解程度顯著，說明蛋白對胃蛋白酶較敏感。由圖2可知，隨消化時間延長，蛋白水解度逐漸增加，且在最初消化的30 min內水解度增加尤為顯著，消化60 min后水解趨于穩定，這是樣品底物質量濃度及酶活隨反應進行而降低，復合物經初始階段積累達到穩態，并趨于恒定等原因造成的[26]。研究表明，隨樣品中花青素質量增加，蛋白質消化率呈下降趨勢，且花青素質量配比越大，蛋白水解受到的影響越大。空白組蛋白在經90 min消化后，水解度高達48.5%；SPI與花青素質量比為1∶0.01時蛋白最終水解度為45.8%，水解度降低不明顯；質量比為1∶0.02時水解度為42%，但增加至1∶0.05的質量比時蛋白的水解度顯著降低，僅有36.5%。這表明花青素的添加對蛋白消化具有一定不利影響，推測是由于SPI與花青素發生結合并使自身空間結構發生部分程度變化導致的。同時，花青素等多酚類物質還具有一定程度沉淀蛋白質的特性[27]，由于SPI主要由球蛋白組成，這種蛋白質分子極性基團朝向外部，可以與極性水分子相互作用，添加花青素后，可能由于SPI的側鏈氨基酸極性基團與花青素的酚羥基結合，導致蛋白質分子體系極性下降，溶解度降低。而蛋白質的溶解性又與其功能、加工及消化特性等息息相關，因此花青素對蛋白的沉淀性也是對蛋白水解度產生影響的因素之一。酚類化合物絡合對蛋白水解度的影響與酚類化合物及蛋白種類和性質等多因素有關，兩者互作對各自的影響也是一個相對復雜的過程。

2.3 SPI及其消化產物亞基組成分析

圖3 SPI及SPI-花青素復合物中蛋白體外消化SDS-PAGE圖譜Fig. 3 SDS-PAGE analysis of in vitro pepsin digests of SPI and SPI-anthocyanins complexs

如圖3所示，添加不同質量花青素的蛋白樣品中各組分受胃蛋白酶的降解情況有顯著差別。4 組樣品中的β-伴大豆球蛋白相較于大豆球蛋白更易于被胃蛋白酶酶解，且大豆球蛋白在經過連續90 min的消化后也僅有部分被酶解。除圖3a樣品外，其余樣品經胃蛋白酶酶解60 min后，α’-亞基及α-亞基的電泳條帶對應組分完全被消化降解，圖3a樣品在經過連續消化90 min后該處組分仍有部分未能被降解。針對大豆球蛋白而言，相對不易被消化，降解程度也較小，其A1～A4亞基及B亞基僅在圖3a樣品中有稍明顯水解，從而降解為相對分子質量小于17 kDa的蛋白肽。而對另外3 組樣品而言，大豆球蛋白的消化皆不明顯。

SDS-PAGE顯示，添加不同質量花青素的樣品中蛋白消化程度具有較顯著區別。對照組圖3a中蛋白消化水解相對徹底，隨著花青素添加量的增多，蛋白質整體消化程度逐漸降低，具體表現為花青素的添加促進了以α-亞基條帶組分為代表的β-伴大豆球蛋白亞基的消化，但卻顯著抑制了大豆球蛋白中各亞基組分消化，且尤以圖3d中花青素添加量為最大時對蛋白消化影響最為顯著，這與圖2中蛋白質水解度的測定結果相吻合。胃蛋白酶對不同蛋白組分的消化情形與其空間結構緊密相關，花青素的添加部分程度改變了蛋白質的二級、三級結構，最終使其添加對蛋白的水解消化產生了一定不利影響。

然而，即使花青素的添加部分程度的降低了蛋白水解度，但由圖3可看出，花青素以上述任何比例添加進蛋白樣品時，都能夠有效促進7S球蛋白中α-亞基的水解，而據相關研究表明，α-亞基為大豆蛋白致使機體產生免疫反應的主致敏原之一[28]，且經蛋白酶體外酶解可以部分去除該亞基組分[29]，因而推測花青素對7S球蛋白消化的促進作用能夠降低大豆蛋白致敏性，該結論對大豆蛋白相關產品的生產加工具有一定的積極作用。

2.4 SPI及其消化產物分子質量分布分析

因體積排阻色譜柱的填料凝膠含大量微孔，所以樣品在經過體積排阻色譜柱時，僅其中分子質量較小的組分及緩沖溶液得以通過，進而使較大分子質量組分被阻擋于外部，因此樣品在填料間隙內流動時較大分子質量組分首先被洗脫，小分子質量組分隨后被洗脫[30]。

根據最小二乘法計算出該蛋白標曲回歸方程：y=-2.002 6x+17.620，其中x為蛋白質分子質量對數，y為洗脫時間。利用該式即可根據蛋白樣品的分子質量估算出對應組分的洗脫時間。各蛋白樣品及消化產物分子質量分布如表1所示。

表1 未添加花青素的SPI消化產物分子質量分布Table 1 Molecular mas distribution of SPI hydrolysates

SPI主要是由7S和11S兩種球蛋白組成，7S的分子質量范圍在150～200 kDa，由3 個亞基組成，亞基的分子質量范圍在42～83 kDa之間；11S的分子質量范圍在300～380 kDa之間，由6 個亞基組成，每個亞基由一個酸性多肽和一個堿性多肽組成，多肽的分子質量范圍在10～35 kDa之間。蛋白體外模擬消化進程中，分子質量變化是一個動態過程，蛋白由際水解為胨，最后被徹底水解為小分子肽。由表1可知，未水解的大豆蛋白分子質量主要集中在10 kDa以上，特別以分子質量高于100 kDa蛋白居多，比例高達83.12%。而此時，分子質量在3～10 kDa之間的小肽含量微乎其微。隨消化進行，分子質量100 kDa以上蛋白比例逐漸減小，在消化至15～30 min時其含量大幅度降低，并于消化終點時比例降至29.93%。同時，分子質量分布為10～100 kDa的蛋白肽含量呈現出先增加后降低的趨勢，這可能由于在消化初期，分子質量100 kDa以上蛋白逐漸被消化，致使分布為10～100 kDa的蛋白肽含量有所增加，隨著消化反應進行，分布在10～100 kDa的蛋白肽也進一步被水解成更小的肽片段，而大于100 kDa以上蛋白隨后水解的更為徹底造成的，這也使得3～10 kDa及小于3 kDa的蛋白肽含量有較為明顯的上升。最終，蛋白消化產物的分子質量主要集中在3～100 kDa之間，這與SDS的分析結果一致。

表2 SPI-花青素（1∶0.01）消化產物分子質量分布Table 2 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.01) complex

表3 SPI-花青素（1∶0.02）消化產物分子質量分布Table 3 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.02) complex

表4 SPI-花青素（1∶0.05）消化產物分子質量分布Table 4 Molecular mass distribution of hydrolysates of SPI-anthocyanin (1:0.05) complex

通過對表2～4與表1比較發現，在未消化的4 種樣品中，蛋白質分子質量主要都集中在100 kDa以上，且所占比例相似。隨消化時間延長，大于100 kDa的蛋白逐漸被消化，且消化均在30 min內較明顯，但添加的花青素量越大，各消化時間點對應的消化產物中該分子質量蛋白所占比例的降低越不顯著，這主要是由于花青素的添加，降低了蛋白水解程度。消化初期，各樣品中低于10 kDa分子質量的蛋白肽含量均很少，隨著反應進行，大分子質量蛋白逐級水解，消化終點處，空白組中10 kDa以下蛋白肽含量增加至35%，添加花青素的蛋白樣品中其含量也有所增加，但消化最不明顯的樣品組其含量只增加至20%，同時各樣品中蛋白肽分子質量多集中在3～10 kDa之間。10～100 kDa分子質量肽段均呈現先增加后減小的趨勢，主要由于消化初期，高于100 kDa的蛋白初步水解成10～100 kDa分子質量肽段，而后期則是因100 kDa以上的蛋白及10～100 kDa分子質量多肽進一步水解使其含量降低，也因此使得更小分子的肽含量有所增加，但花青素添加量的增多，導致最終水解產生的小分子肽含量降低，這也是由于底物受花青素影響水解不夠徹底造成的，這與SDS的分析結果也是相吻合的。

2.5 大豆蛋白及消化產物空間構象分析

2.5.1 SPI及消化產物圓二色譜分析

圖4 未消化大豆蛋白（a）和體外模擬消化后大豆蛋白（b）樣品的圓二色譜圖Fig. 4 CD spectra of SPI (a), SPI-anthocyanin complexes and hydrolysates (b)

表5 圓二色譜測定天然及SPI-花青素復合物中大豆蛋白的二級結構含量Table 5 Secondary structure contents in SPI and SPI-anthocyanin complexes%

表6 圓二色譜測定不同質量比花青素復合的SPI消化產物二級結構含量Table 6 Secondary structure contents in digests of SPI and SPI-anthocyanin complexes%

圓二色譜是一種高效而精確定性定量分析蛋白二級結構的常用手段，能夠在液體蛋白樣品中進行直接測定[31]。本實驗選擇能夠反映肽鍵圓二色性的遠紫外區（190～260 nm）光譜條件，對天然及與花青素復合后的SPI經1.5 h體外模擬消化前后的蛋白樣品進行圓二色譜分析。圖4a為天然及與花青素復合后的蛋白圓二色譜圖，圖4b所示為體外模擬消化后大豆蛋白圓二色譜圖，SPI與花青素復合后二級結構含量變化見表5，對應消化產物的二級結構變化見表6。在205 nm和217 nm波長處的摩爾橢圓度有兩個最小值，在190～195 nm附近有一最大正值，該值為蛋白質α-螺旋的典型特征峰。圖4a顯示隨著花青素添加量的增多，α-螺旋的典型特征峰逐漸降低，表明蛋白質二級結構發生了變化。圖4b中在190～195 nm左右處的橢圓率顯著降低，表明在消化過程中α-螺旋結構有較明顯損失。同時，當蛋白水解時，217 nm波長處的橢圓率負值有所減少，這也表明蛋白二級結構被破壞[32]。由表6可知，SPI與花青素復合后，α-螺旋含量降低，β-折疊含量遞增，β-轉角含量高低浮動整體無明顯變化，無規則卷曲含量升高，這些現象可能是由于花青素結合到了SPI α-螺旋中的某些氨基酸區域，進而蛋白分子部分展開，空間構象被改變所致，且該現象在花青素質量配比增大后更顯著。謝鳳英等[33]研究表明，多酚化合物的添加會使米糠蛋白的α-螺旋含量降低，β-折疊結構含量先升高后降低，而無規則卷曲結構的含量增加，這與本實驗結果一致。同時，也有相關研究表明，綠原酸、阿魏酸與香豆酸（香豆酸）等酚類物質同α-乳白蛋白及β-乳球蛋白互作，能夠降低α-螺旋含量，增加β-折疊和轉角含量。天然及添加花青素的蛋白樣品消化后，α-螺旋及β-折疊結構含量均降低，且花青素質量配比越大，消化后α-螺旋及β-折疊含量降低值越小，蛋白二級結構變化越不明顯，推測是因各花青素與蛋白復合，可能在某種程度上影響蛋白酶解程度，使各酶解產物與對應未消化樣品間的空間構象存在不同程度的差異。消化30 min時，α-螺旋及β-折疊含量降低較明顯（表中未給出），表明兩者的消化水解主要發生于反應初期，并推斷α-螺旋和β-折疊結構的消化可能增加了無規卷曲的含量，各結構間可能存在相互轉化關系。

2.5.2 SPI及消化產物熒光光譜分析

圖5 同一蛋白樣品不同消化時間熒光譜圖Fig. 5 Fluorescence emission spectra of digested SPI samples at different periods

圖6 不同蛋白樣品同一消化時間熒光譜圖Fig. 6 Fluorescence emission spectra of digested SPI-anthocyanin complexes at each period

蛋白質分子可解離的基團除氨基和羧基外，還有大量凸出的側鏈基團，如組氨酸的咪唑，酪氨酸的羥基等。消化過程中蛋白質主側結構解離與重聚的變化能夠使蛋白質分子中可解離基團的電離情況發生變化，從而使蛋白質的空間結構發生改變。因此通過研究不同消化程度的消化產物中蛋白熒光性質變化，可以得出不同消化程度條件下大豆蛋白三級結構改變的信息。290 nm波長處激發產生的熒光光譜主要是由蛋白質分子中的色氨酸殘基發射的，色氨酸殘基是蛋白質的主要內源熒光源，通過記錄色氨酸的熒光圖譜，以反映色氨酸殘基所處微環境變化情況，從而揭示出在不同體外模擬消化時間內花青素質量濃度對蛋白質三級結構的影響。

如圖5所示，各樣品的SPI在連續1.5 h的消化過程中，λmax均分布在346.6～350.6 nm內，且隨消化時間延長，消化產物的λmax整體呈紅移趨勢，表明蛋白在消化過程中逐漸解離，蛋白分子內部的發色基團暴露在外部極性環境中；也有部分暴露于分子外部極性環境的色氨酸殘基轉向分子內部非極性環境中，蛋白質的三級結構發生了改變。由圖6可知，未消化樣品中，隨花青素添加量增大，大豆蛋白最大熒光發射波長λmax發生紅移，由346.2 nm偏移至350.2 nm，說明花青素與大豆蛋白發生了結合，從而改變了蛋白構象，色氨酸微環境發生改變，由疏水環境變為親水環境，肽鏈結構舒展。任一相同消化點時，隨花青素質量配比的增加，消化產物的λmax均逐漸發生紅移，這與花青素質量配比增加，樣品中—OH基團增多有關，同時，也是由于更多的色氨酸殘基暴露在極性環境中及蛋白質結構的舒展導致[34]。

此外，花青素質量配比的增加會導致蛋白樣品在任一相同消化時間點的蛋白熒光強度降低，特別是SPI與花色素質量比為1∶0.05時，這也說明蛋白質結構展開，花青素與色氨酸殘基間發生了互作而削弱了SPI的熒光強度[34]。

3 結 論

體外模擬消化實驗表明，隨消化時間延長，大豆蛋白消化程度逐漸增加，且水解主要發生在消化前30 min。花青素的添加會降低蛋白質水解度，且花青素質量配比越大，抑制消化效果越明顯。

采用SDS-PAGE對各蛋白樣品及消化產物進行亞基組成分析，表明胃蛋白酶對蛋白各組分消化性能有較顯著差異，7S較11S球蛋白更易被消化，花青素的添加抑制11S蛋白水解，卻能夠有效促進大豆蛋白主要致敏原α-亞基降解，推測花青素的添加可有效降低大豆蛋白食用致敏性。

利用排阻色譜分析蛋白樣品及消化產物分子質量分布，結果表明，隨消化反應的進行，大分子質量蛋白逐漸被水解成小分子肽，最終分子質量分布集中在3～100 kDa之間，同時花青素的添加使得最終消化產物分布在3 kDa以下的蛋白肽含量減少，這與SDS-PAGE分析結果一致。

圓二色譜分析結果表明，花青素改變了SPI構象，主要表現在α-螺旋結構含量降低，β-折疊含量增加，β-轉角變化無明顯規律，無規則卷曲含量增加，構象的變化對蛋白的消化過程及水解度產生一定程度影響，從而造成消化產物結構也被不同程度的改變。

熒光分析表明，蛋白及消化產物中，色氨酸殘基分布于蛋白分子外極性環境中，且隨花青素質量配比增加，消化產物的λmax逐漸紅移。大豆蛋白在消化過程中逐漸被解離，熒光基團暴露于溶劑中，但花青素的添加對蛋白有顯著熒光猝滅效果。