血管內皮生長因子基因多變與骨肉瘤發生的可能性研究

張洪飛 閆加鵬 韓桂全

【摘 要】目的：探索VEGF-2578C/A，936C/T和-460T / C基因多態性在骨肉瘤發展過程中的表達水平，從而研究二者可能存在的先關性。方法：將我院自2014年1月至2017年01月的90例骨肉瘤患者和90例健康對照組成員納入本研究進行基因多態性的對比分析。結果：對照組的VEGF-2578C/A和-460T / C基因型頻率符合哈迪-溫伯格平衡參數，但936C/T基因型頻率并不在此范圍內。骨肉瘤患者-2578C/A 的AA基因型（OR = 1.90；95%可信區間 = 1.00-3.78）和CA+AA基因型（OR = 1.53；95%可信區間 = 1.00-2.25）相對于CC基因型而言是顯著增加的。結論：-2578C/A的AA基因型與CA+AA 基因型提高了骨肉瘤的患病率。

【關鍵詞】血管內皮生長因子；基因多態性；骨肉瘤

【中圖分類號】R181.3+2 【文獻標志碼】

A

【文章編號】1005-0019（2018）11-065-01

骨肉瘤來源于間葉組織，好發于長干骨如股骨遠端、脛骨和肱骨的骨骺端。骨肉瘤多見于兒童和青少年，約有3 / 1000000的發病率[1]。骨肉瘤的發展是個復雜的、多步驟的、多因素參與的過程[2]，腫瘤干細胞及其潛在性導致了腫瘤的發生，這也提示遺傳因素在骨肉瘤的發展過程中起著重要的作用[3、4]。研究證實，腫瘤的潛在侵襲性與血管內皮細胞中新生的血管有關[5、6]，血管內皮生長因子及新生血管的形成是腫瘤發生發展過程中的一個基本步驟[7]。血管內皮生長因子（VEGF）是一種強效的促血管生長因子，VEGF的多態性可以通過改變內部的轉錄和翻譯來影響該基因的表達[8]，一些單核苷酸多態性比如-2578C/A、936C/T和460T/C被證實可以影響VEGF蛋白的合成。越來越多的研究證實VEGF多態性和腫瘤之間的關聯性[9-11]，但目前只有兩個研究報道了VEGF基因與骨肉瘤患病風險性之間的關聯[12、13]。本研究旨在探索VEGF-2578C/A， +936C/T 和-460T/C基因多態性在骨肉瘤發生發展中表達水平的變化。

研究方法

研究人群：本課題將濰坊醫學院附屬醫院自2014年1月至2017年01月的90例骨肉瘤患者和90例年齡和性別無差異的健康對照組成員納入本研究進行研究分析。所有的骨肉瘤患者都是初次患病，由兩位病理學醫生分別進行了確診，從臨床和病理兩方面來獲取骨肉瘤患者資料，其中包括性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤部位、腫瘤轉移和腫瘤家族史。對照組成員為我院健康體檢的志愿者，均為非骨肉瘤患者，且自身沒有任何癌癥病史，無一級親屬骨肉瘤患病家族史。本研究方案經由濰坊醫學院附屬醫院倫理委員會批準通過，根據赫爾辛基宣言對所有參與者簽署書面知情同意書。

研究方法：用DNA提取試劑盒從外周血白細胞中提取DNA，PCR-RFLP法來研究VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C基因多態性表達差異。通過分子檢測3.1軟件來為VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C設計PCR引物。PCR反應的步驟如下：在Perkin-Elmer 9700的熱循環儀里進行94°C下8分鐘的初始變性，然后在94°C下 30秒內進行30個周期變性，在60°C退火30秒，在72°C 下進行1分鐘延伸。PCR產物被NlaIII限制性內切酶（紐英倫公司，貝弗利，MA）進行酶解。由此產生的DNA片段，經3.5%瓊脂糖凝膠下進行電泳，經過ethidum染色，在可視化的紫外線照射下透視。

使用SPSS 16版統計軟件進行統計分析，連續變量之間的差異采用t檢驗評估，分類變量之間均采用皮爾遜x2檢驗來評估。對照組中VEGF-2578C/A，+936C/T 和 -460T/C基因多態性的哈代-溫伯格均衡參數用皮爾遜x2檢驗。組間的基因型頻率存在的差異則用皮爾遜x2檢驗手段、比值比（OR）和95%可信區間（CI）來評估。P值<0.05具有顯著統計學差異。

結果

骨肉瘤患者和對照組的特性如表1所示，實驗組和對照組之間在年齡（P = 0.69）、性別（P = 1）、腫瘤家族史（P = 0.44）方面無統計學差異，其中骨肉瘤組平均年齡為21.3±11.5歲，對照組平均年齡為21.2±11.9歲。實驗組中68.89%的骨肉瘤發生在長管狀骨，其余31.11%位于軀干中軸骨骼；38.89%的骨肉瘤組患者出現腫瘤轉移，其余的61.11%患者未發生轉移。對照組的VEGF-2578C/A和460T/C基因頻率在哈迪-溫伯格平衡參數內，但936C/T基因型頻率不在哈迪-溫伯格平衡參數內（表2）。對照組中的VEGF-2578C/A，936C/T和460T/C的次要等位基因頻率（MAF）與中國大眾人口NCBI數據庫中的相一致。同-2578C/A的 CC基因亞型相比，-2578C/A 的AA基因型（OR = 1.90；95%可信區間 = 1.00-3.78）和CA+AA基因型（OR = 1.53；95%可信區間 = 1.00-2.25）在骨肉瘤風險中是顯著增加的（表3） 。+936C/T和-460T / C基因多態性與骨肉瘤風險之間的關聯性并沒有顯著的意義。

討論

遺傳因素和某些導致DNA損傷的環境因素與骨肉瘤的發生發展有關[14]，VEGF基因被認為是其中的一個重要遺傳因素[12、13]。本研究旨在探索VEGF基因多態性與中國人口中骨肉瘤風險之間的關聯性，證實了-2578C/A的AA基因型和CA+AA基因型與骨肉瘤風險增加有關。新的血管生成在腫瘤的發生和轉移過程中起著重要作用，而血管內皮生長因子是血管生成的關鍵因子，它能促進內皮細胞增殖和改變血管細胞外基質[15]。研究證實，在多種腫瘤中都有血管內皮生長因子的高度表達，并且它與促進腫瘤組織血管密度呈正相關[16]。血管內皮生長因子的基因多態性被證實與乳腺癌、肺癌、大腸癌、胃癌和前列腺癌等多種腫瘤的敏感性有關。目前僅有兩個針對VEGF基因多態性與骨肉瘤風險性之間關聯性的研究，Tie[12]將單核苷酸與骨肉瘤的患病率之間相關性進行了研究分析，證實了VEGF-2578C/A和-634G / C的多態性可能增加骨肉瘤患病率。Wang[13]等人發現VEGF基因中的三個常見單核苷酸多態性對于骨肉瘤的敏感性有著潛在影響，認為-634G/C 的T等位基因可能與中國人群的骨肉瘤多態性有關，但這都需要進一步的研究來證實。

本研究證實VEGF -2578C/A的AA和CA基因亞型可能增加了中國人群中骨肉瘤的患病率，血管生長因子在骨肉瘤病因學中起著重要的作用。

參考文獻

[1] Mirabello L， Troisi RJ， Savage SA （2009）. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004： Data from the surveillance， epidemiology， and end results program. Cancer. 115：1531-1543.

[2] Powers M， Zhang W， Lopez-Terrada D， Czerniak BA， Lazar AJ （2010）. The molecular pathology of sarcomas. Cancer biomarkers： section A of Disease markers. 9：475-491.