miR-22-3p 在腹主動脈瘤中對金屬基質蛋白酶-9作用的實驗研究

戴 楠 劉 暢 陳博雅 李玉琳 王綠婭 杜 杰

腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)是常見的心血管危重疾病，其特點是腹主動脈壁全層的永久性擴張[1]，AAA常無明顯癥狀，但其破裂后病死率達80%～90%。細胞外基質的降解是現在工公認的腹主動脈瘤發生機制之一，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是維持主動脈血管壁結構彈性及完整性的主要成分,基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是導致細胞外基質降解的主要因素。近年來，臨床上對腹主動脈瘤的治療手段以手術為主，沒有有效的內科治療方式[2-5]。目前研究表明，MicroRNA (miR)在腹主動脈瘤發病機制中如炎癥、ECM的重構、凋亡或細胞的分化中發揮了重要的調控作用[6-8]。本課題組前期研究發現在小鼠腹主動脈瘤模型血管組織測序結果中miR-22-3p明顯下調，提示miR-22-3p在腹主動脈瘤發生發展中發揮重要作用。本研究旨在探討miR-22-3p對于腹主動脈瘤中MMP-9的表達影響，為該病治療提供新的線索。

材料與方法

1.藥物、試劑和儀器 血管緊張素II(Ang-II，10mg，美國sigma公司)、agomiR(廣州市銳搏生物有限公司)、10% 三氯乙酸(YiLi 公司)、MMP-9抗體(兔來源，Santa公司)、兔二抗、DAB 顯色液(北京中杉金橋)、3%BSA(自配)、置入式膠囊滲透壓微量泵(alzet MICRO-OSMOTIC PUPM MODEL 1007D 美國)、Vevo770 小動物超聲成像系統(Visual Sonics Inc)。

2.實驗動物及分組 8周齡，C57BL/6雄性，野生小鼠及apoE基因敲除雄性小鼠，體質量22～24g，由北京市華阜康生物科技有限公司提供，實驗動物使用許可證號：SCXK(京)2011-0004。飼養于無特定病原體級動物房，給予清潔飲水和飲食。20只apoE基因敲除(apoE-/-)雄性小鼠均等為血管緊張素II(Ang-II)組與對照組，對照組無處理，Ang-II組給予Ang-II(1 500ng·min-1·kg-1,6w)微量泵持續灌注。又取10只apoE-/-雄性小鼠隨機分為實驗組與對照組，均給予Ang-II微量泵灌注，agomiR-22組內眥靜脈注射agomiR-22，對照組內眥靜脈注射agomiR空載體(agomiR-NC)，每5天1次。

3.小鼠腹主動脈瘤模型制備 適齡apoE敲除小鼠通過皮下置入血管緊張素II 灌注(1 500ng·min-1·kg-1, 6w)微量泵，Ang-II組微量泵內直接注入0.01% 乙酸溶液，建立腹主動脈瘤模型。用1% 戊巴比妥鈉溶液以20mg/kg 腹腔內注射麻醉，小鼠腹部皮膚除毛，75% 乙醇棉球消毒，剪開皮膚，鈍性分離皮阻止癌下，埋入預置血管緊張素II微量泵，縫合皮膚，待小鼠蘇醒后送入鼠房。

4.心臟超聲心動圖檢查 血管緊張素II灌注后6周，使用Vevo770小動物超聲成像系統及707B(30Hz)超聲探頭檢測其心功能。

5.組織病理切片機及免疫組化染色 灌注后取材，組織經過10%的甲醛固定，95%乙醇脫水、石蠟包埋，垂直于血管內徑連續切成5mm的石蠟組織切片，行免疫組化染色[9-10]。

6.小鼠原代細胞分離與培養 取野生型小鼠2只處死，無菌臺取出主動脈組織。使用滅菌后器械剝離血管外脂肪組織，膠原酶浸泡血管，放置于恒溫箱中37℃，30min后剝離血管外膜，將其剪碎離心后棄上清，重懸細胞后進行培養；將剝離的中膜剪碎后使用彈性蛋白酶于恒溫箱中37℃孵育30min，相同方式獲取細胞懸液且培養；取野生型小鼠2只處死，無菌剝取脛骨、股骨，以相同方式得到細胞懸液，并加入集落刺激因子，刺激巨噬細胞生長。

7.細胞系培養 取平滑肌細胞系MOVAS、成纖維細胞系3T3、巨噬細胞細胞系RAW與人臍靜脈內皮細胞，10% DMED培養，每隔2日換液并進行傳代。

8.實時PCR檢測血管組織中miR-22-3p的mRNA水平 取研缽與液氮提取血管組織或Trizol試劑盒提取細胞中mRNA進行PCR擴增后，以U6的表達校正miR-22-3p的表達。引物由Premier 5.1軟件設計，北京諾賽生物科技有限公司合成，引物序列具體如下：上游 5’-GGTTAAGCTGCCAGTTGAA3’，下游 5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT3’，退火溫度60℃。

9.統計方法 使用SPSS 21.0進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，兩組之間比較采用配對t檢驗，計數資料使用率表示，兩組間比較采用卡方檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

圖1 兩組血管超聲結果 A：Ang-II組；B：對照組；圖2 兩組血管組織中miR-22-3p的表達情況 注：兩兩比較，*P<0.05

結 果

1.mir-22-3p在AII灌泵apoE敲除小鼠中的表達情況 Ang-II組可見超聲有瘤形成，成瘤率達40%。實時PCR檢測發現apoE敲除小鼠腹主動脈組織中miR-22-3p的含量下降(0.00079±0.00029)vs. (0.00042±0.00023)(P<0.05，圖1～2)。

2. miR-22-3p的細胞來源 提取野生小鼠血管組織中原代平滑肌細胞、原代成纖維細胞、巨噬細胞及其細胞系，監測基礎情況下各種細胞中miR-22-3p的含量，發現在原代平滑肌細胞及其細胞系中表達最高，見圖3。

圖3 在血管的各細胞中檢測miR-22-3p的表達情況

3.注射agomiR后動脈瘤發生情況 與注射agomiR-NC組相對比，注射了agomiR-22的灌泵小鼠組發生腹主動脈瘤的概率為0(P<0.05)，說明miR-22-3p對于腹主動脈瘤的發生有抑制作用，見圖4。

圖4 注射agomiR后兩組腹主動脈瘤發病率比較A：大體圖 B：超聲結果 注：兩兩比較，*P<0.05

4.注射agomiR后腹主動脈瘤組織中MMP-9的表達變化情況 與注射agomiR-NC組相對比，注射agomiR-22可看出血管中MMP-9表達水平下降(圖5)。

圖5 注射后兩組血管組織MMP-9染色比較A：注射agomiR-NC；B：注射agomiR-22

討 論

ECM是維持主動脈血管壁結構彈性及完整性的主要成分，腹主動脈瘤的ECM由平滑肌細胞與成纖維細胞合成，始終處于合成、降解的動態平衡中，其過度降解是現在公認的腹主動脈瘤發生機制之一[11]。MMPs是導致細胞外基質降解的主要因素，MMP-9基因型與AAA的發病有顯著的相關性[12]。實驗證明，MMP-9基因表達在AAA中高表達[13]，腔內血栓形成激活了MMP-9的活性，MMP-9與MMP-2的協同作用在AAA的擴大和破裂中發揮了重要的作用[14]，它們影響了AAA的發展、動脈壁的穩定性和造成了腹主動脈瘤的破裂。 miR-22在干細胞及動脈外層干細胞向平滑肌細胞分化的過程中顯著上調[15]，并在許多研究中與提示其對細胞遷移有調節作用，平滑肌細胞的分化與遷移是導致ECM與MMP動態變化的重要因素，與AAA的發生密切相關。

本實驗通過血管緊張素II微量泵灌注構建腹主動脈瘤模型，探索miR-22-3p在腹主動脈瘤發生中的作用。發現在血管緊張素II灌注6周后，小鼠腹主動脈有瘤形成，說明建模成功。檢測對照組與微量灌泵組血管組織中miR-22-3p的含量，可見在灌泵組中miR-22-3p的含量顯著下降。為了研究miR-22-3p在組織中的細胞來源，我們分離野生小鼠血管組織培養原代細胞與各細胞系，表明miR-22-3p在正常情況下于平滑肌高表達。在apoE敲除小鼠微量灌泵模型中注射agomiR-22，觀察兩組的成瘤率差別，發現在補充了足夠的miR-22后，腹主動脈瘤成瘤率大幅度下降，表明miR-22-3p可以阻止腹主動脈瘤的形成。免疫組化染色結果表示在注射了agomiR-22的小鼠中MMP-9的含量較注射agomiR-NC組減少，提示我們miR-22-3p可以通過調節MMP-9含量從而影響腹主動脈瘤的發生率。

綜上所述，本研究首次觀察到在AII誘導的腹主動脈瘤中組織中miR-22-3p下調，且正常情況下在平滑肌中高表達，補充足夠的miR-22后可以抑制腹主動脈瘤的發生，可能與MMP-9的含量變化有關，但具體調節機制需要進一步研究。