真空冷凍干燥對乳酸菌損傷機制的研究進展

李明慧，尚一娜，霍麒文，陳 境，張曉寧，邢葉妮，楊姝玉，王俊國*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，農業農村部奶制品加工重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018）

乳酸菌真空冷凍干燥是將乳酸菌細胞懸浮液凍結后，提高真空度使冰晶在低溫條件下升華變成凍干粉狀態的技術[1]。該方法主要是依據微生物的生理、生化特點，使菌株的代謝處于不活潑的狀態，生長和繁殖受到抑制，達到休眠的狀態，以保持菌株的原有特性[2]。真空冷凍干燥技術發明于20世紀60年代初期，現已在工業化生產中大規模使用。與其他保藏菌株的方法相比，經過冷凍干燥技術處理后的菌株含活菌數量較高，發酵活力較好，遺傳特性較為穩定，同時它在儲存和運輸等方面成本較為低廉，因此冷凍干燥技術有助于菌體貯藏與應用[3-4]。

但冷凍干燥也會導致乳酸菌菌體活力下降甚至死亡[5-6]。為了探究冷凍干燥導致乳酸菌發酵劑失活的機制，國內外學者們進行了大量的研究，發現冷凍干燥后細菌的存活率以及發酵活力降低的主要原因有以下幾個方面：冷凍和干燥過程造成的細胞膜通透性增加、膜流動性降低、細胞酶及相關蛋白質變性和核糖核酸結構變化等[7-8]。

盡管大量研究證明冷凍干燥會對乳酸菌的發酵活力造成一定程度上的損傷，并提出了相應的解決辦法，但沒有對其失活機制進行系統地分析，本文以細胞膜、酶、蛋白質以及遺傳物質等為主要對象，對真空冷凍干燥的損傷機制進行了詳細的總結，為制備冷凍干燥高效濃縮型乳酸菌發酵劑提供一定的參考。

1 冷凍干燥對細胞膜通透性的影響

1.1 冷凍干燥對細胞膜通透性的作用方式

細胞膜可以使菌體與外部環境隔離，是保護乳酸菌的主要屏障，因此膜是否完整、是否受損是冷凍干燥過程中最受關注的焦點[9]。

在冷凍干燥過程中，有許多因素會影響膜的通透性，進而造成細胞膜的損傷。這主要與冷凍過程中冰晶的形成以及干燥過程中磷脂雙分子層的損傷有關。其中冰晶的形成有可能會導致細胞膜的機械損傷，這也是造成細胞死亡的主要原因。在冷凍干燥的預凍過程中，菌株內的游離態水凍結后會形成冰晶，一般冰晶越大，細胞膜越容易破裂，細胞越容易死亡；冰晶越小，對細胞膜的機械損傷也較小[10]。同時在冷凍過程中溫度的波動也會使胞內冰晶發生重結晶，使冰晶變大，破壞細胞膜。

如圖1所示，在凍結過程中，凍結速率的變化會導致細胞內外水分含量的變化，細胞懸液以1 ℃/min的速率降溫至-20～-40 ℃，1 h左右達到凍結視為慢速凍結；而細胞懸液以10 ℃/min以上的速率降溫至-20～-40 ℃，短時間內達到凍結視為快速凍結[11]。若冷凍速率較快，胞內水分還來不及外滲就被凍成冰晶，會造成冰晶體積過大使細胞受到機械損傷，這種胞內凍結形成的冰晶會對細胞產生傷害；若冷凍速率較慢，游離水在細胞外部形成冰晶，胞內水分則會外滲到胞外，細胞外形成的冰晶本身或冰晶形成的過程會對細胞造成較大的傷害。冷卻速率的緩慢或快速是相對的，并且不同的菌株所需的凍結速率有所不同，因此針對不同菌株應選用最適于該菌株的凍結速率。采用最適凍結速率進行冷凍時，雖然菌體細胞內的水分會滲透到細胞外，但細胞體積收縮較小，結構仍與原來相似，且降低了菌體細胞的發酵活性，因此對細胞產生的傷害遠遠小于大量水分在胞內凍結所產生的傷害[12]。

圖 1 凍結速率對冰晶形成的影響[13]Fig. 1 Effect of freezing rate on crystal growth[13]

除此之外，冰晶對乳酸菌的影響還與菌體的形狀有關。通過對比相同條件下的球菌和桿菌的凍干存活率，發現菌體表面積越大的細胞存活率越低，而且細胞的表面積越大，在冷凍過程中形成的冰晶對膜的損傷越大[14]。

細胞膜中磷脂的極性端在一定程度上以水合形式存在，而且每個磷脂的極性端與其他磷脂分子的極性端被水分子隔開，當磷脂干燥脫水時，以氫鍵相連的水分子從磷脂雙分子層的頭部基團移走，頭部位置出現空位，酰基會強加到頭部空位上，鏈間范德華力增強，而且磷脂分子會由液晶相向凝膠相轉變；因此磷脂分子間可能出現空位，膜的滲透性加大，使細胞內的酶泄漏及胞內蛋白質溶出等，進而導致細胞活力下降，產酸性能降低[15]。Basholli-Salihu等[16]通過對比冷凍和冷凍干燥的菌體活性以及細胞膜內外酶活力發現，菌體經過冷凍干燥后其酶活力及發酵活力的下降程度均高于冷凍樣品，說明干燥過程中細胞失水造成的損傷會導致菌的活力進一步下降。

前人研究發現冷凍干燥后保加利亞乳桿菌細胞膜的通透性出現損傷，細胞內外離子發生轉移，細胞內部的離子環境發生改變；因此可依據這種離子濃度的改變，評價細胞膜損傷的情況[1]。王飚等[17]通過特異性熒光探針法測定了冷凍干燥過程中細胞膜對H+和Ca2+的通透性變化，研究了乳酸菌細胞膜在冷凍干燥過程中完整性的變化；結果顯示，與凍干前相比，凍干后細胞內pH值明顯下降，胞內外pH值梯度遭到了破壞，細胞膜對H+的通透性增大；另外，冷凍干燥也會導致細胞外的鈣離子濃度增加，亦說明細胞膜的通透性增大。同時有研究還發現β-半乳糖苷酶活力的高低能反映細胞膜通透性的改變情況，通過測定細胞內滲出胞外的β-半乳糖苷酶活力可判定細胞膜損傷的情況。經研究，對比添加保護劑和未添加保護劑的胞外β-半乳糖苷酶活力，發現未添加保護劑的胞外β-半乳糖苷酶活力更大；說明冷凍干燥會造成細胞膜通透性增大，造成菌體發酵活力下降[18-19]。

1.2 減少細胞膜損傷所采取的措施

近年來有學者通過調整冷凍溫度和速率減小冰晶體積，從而減輕細胞膜損傷對菌體造成的不利影響。李寶磊[19]通過測定冷凍干燥后的Streptococcus thermophilus SP1.1發酵活力，發現經過液氮（-196 ℃）冷凍處理后的菌體發酵活力變化最小；這是由于胞內游離水在超高速冷凍速率下形成微晶體，減少了對細胞膜的損傷。所以選擇合適的預冷凍速率對菌體活力的提高也尤為重要。

以脫脂乳作為凍干保護劑可以穩定細胞膜的結構，減少或防止冷凍干燥對細胞的損傷，而且細胞在復水時也可防止膜受到沖擊。另外在脫脂乳中添加其他成分的復合保護劑可以成倍地增強對菌體的保護作用。曾小群等[20]采用脫脂乳復合保護劑，制備出Lactobacillus casei凍干存活率達98.74%的高活性酸奶發酵劑。增加Ca2+與吐溫-80的添加量，可以達到維持細胞膜流動性的作用，對菌體的凍干存活率有顯著提高作用[21]。添加甘油也可以保護細胞膜的完整性，因為甘油具有很強的親水性，能夠穩定細胞膜的結構，減少或防止細胞遭受干燥脫水的損傷，并且細胞在復水時也可防止膜結構受到沖擊[22]。

2 冷凍干燥對細胞膜流動性的影響

2.1 冷凍干燥對細胞膜流動性的作用方式

細胞膜的流動性對于細胞的物質運輸、細胞識別、細胞免疫、細胞分化與信息轉導等都有著重要意義。低溫條件下，磷脂分子由于脂酰鏈的相互靠近產生疏水間力，使磷脂分子呈有序的剛性狀態，即凝膠態；隨著溫度的升高，脂酰鏈因布朗運動加強而排列疏松，脂雙層呈現相對無序狀態，即液晶態（圖2）。兩種狀態的轉變溫度稱為相變溫度，在冷凍干燥過程中，伴隨著水分含量的減少，磷脂分子會由液晶態向凝膠態轉變，造成磷脂分子流動性下降。膜的流動性受磷脂分子脂酰鏈飽和度和長度的影響，飽和度較高時脂鏈延展充分，更易借助范德華力相互靠近形成晶狀體列陣，同時脂酰鏈越長，越易通過疏水力相互聚合成穩定的凝膠態，導致細胞膜流動性下降[23]。

圖 2 水分含量與相轉變關系圖[13]Fig. 2 Relationship between moisture content and phase transition[13]

細菌本身可以通過自我調節來克服細胞膜流動性下降對其造成的不良影響，主要有兩個途徑：增加膽固醇在生物膜中的比例以及調節飽和/不飽和脂肪酸的比例。膽固醇對生物膜的流動性具有雙向調節作用。當膜的流動性過高時，膽固醇的增加可以調節膜的流動性和通透性，從而使膜趨于晶膠態；當膜的流動性過低時，膽固醇可以通過調節使磷脂分子排列更加有序，增強膜的流動性[24]。

在冷凍過程中，乳酸菌可以通過乳酸脫氫酶調節飽和/不飽和脂肪酸的比例。細胞膜脂肪酸成分是影響細胞抗冷凍性的重要指標。脂肪酸的不飽和指數決定了細胞膜的黏度和厚度，高含量的不飽和脂肪酸可以提高細胞膜對凍干的抵抗力[4]。冷凍干燥后乳酸菌細胞膜上的飽和脂肪酸含量下降，而不飽和脂肪酸含量增加；這是由于在相對低的溫度下，細胞膜中乳酸脫氫酶的活力增加，使不飽和脂肪酸含量增加，膜的流動性增強，不飽和脂肪酸中順式雙鍵的存在阻止了脂肪酸分子間的整齊排列，這種排列會導致脂肪膜的流動性下降[25]。

盡管不飽和脂肪酸含量的增加在冷凍過程中可以提高細胞膜的抗冷凍能力，但這些不飽和脂肪酸在有氧條件下儲存過程中也易發生氧化。Hansen等[26]認為細胞膜脂質氧化會對細胞的生存機制造成很大影響。由于不飽和脂肪酸亞甲基上的氫原子較為活潑，易被自由基奪走，產生脂質自由基，與氧氣結合形成脂質過氧自由基，不斷的循環造成脂質鏈不斷延長，導致不飽和脂肪酸含量的減少，降低細胞膜的流動性，影響細胞膜的結構和正常生理功能；脂肪酸氧化產生的自由基對細胞膜的影響還體現在自由基引入親水基團后降低了磷脂雙分子層的疏水性，由于脂雙層的疏水端通過疏水力的作用相互聚攏，自動組裝成雙分子層，而疏水力的降低導致組裝脂雙層的驅動力降低，使脂雙層結構變得不穩定；同時自由基引入的親水基團也會削弱磷脂雙層與內在蛋白質的疏水相互作用，由于細胞膜內蛋白是通過非極性氨基酸殘基與膜脂分子的疏水作用而插入脂雙分子層中，因此疏水作用減弱使內在蛋白（包括膜錨蛋白）的嵌入和移動受到影響，進而影響到細胞膜的功能，而且自由基也可以直接誘導DNA出現損傷。Kandil等[27]也認為膜脂肪酸的氧化是造成微生物細胞在儲存過程中死亡最主要的原因。膜脂肪酸氧化的程度與細胞膜內不飽和脂肪酸及飽和脂肪酸的比值有關[28]。

在冷凍干燥過程中，有些乳酸菌可以將不飽和脂肪酸轉變為環狀脂肪酸。Velly等[29]認為細胞膜中的環狀脂肪酸有助于提高菌株的抗凍能力。在冷凍過程中，菌體以不飽和脂肪酸（棕櫚油酸、異油酸和油酸等）為底物快速合成環式脂肪酸，這個過程是通過對不飽和脂肪酸的一個順式雙鍵進行環丙烷化修飾來實現的。Munoz-Rojas等[30]認為細胞膜中環丙烷脂肪酸含量的增加可以提高菌體細胞膜的流動性。而且環丙烷脂肪酸的化學性能穩定，一旦形成，就會起到穩定細胞膜組成成分的作用；環丙烷脂肪酸的抗氧化能力較強，化學反應活性較低[31]。因此，可以推測細胞膜中環丙烷脂肪酸的積累對菌體提高抗冷脅迫能力可能具有積極的作用。

2.2 改善細胞膜流動性的方法

研究發現可以通過改變培養基成分或培養條件改善細胞膜的流動性。人們發現在低酸環境下生長的乳酸菌，在冷凍干燥時細胞膜的流動性保持的更好。Wang Yu等[32]發現，低pH值條件可以有效改善膜的流動性，使得保加利亞乳桿菌能夠更有效地抵抗冷凍傷害。Palmfeldt等[33]研究表明，培養基pH值為5時，羅伊氏乳桿菌有較強的抗冷凍性，而pH值為6時抗冷凍性較差，說明低pH值可以增強菌株的抗冷凍性。此外對不飽和脂肪酸的成分進行分析發現，較低的pH值可以引起細胞內不飽和脂肪酸的積累。Li Hua等[34]認為發酵結束時低的培養基pH值，更有利于合成環丙烷脂肪酸，可起到提高冷凍干燥存活率的作用。

在培養基中添加一些其他成分也有利于提高細胞膜中不飽和脂肪酸的含量，使細胞膜保持好的流動性。Fonseca等[35]的研究表明，在培養基中添加吐溫-80可以改善乳球菌和乳桿菌的活性，增加細胞膜中不飽和脂肪酸的組成，從而改變細胞膜的流動性，減少冷凍干燥過程中的死亡率。

細胞膜脂肪酸氧化的后果是自由基的形成，這是細胞死亡的主要原因之一。因此為防止細胞膜中不飽和脂肪酸在貯藏期間的氧化，預培養過程中在培養基中添加微量元素、VE、VC等也有利于清除自由基來減少氧化反應。同時處理冷凍干燥樣品的過程中避免高氧、輻射、化學污染以及不良環境因素有助于減少不飽和脂肪酸的過氧化反應。添加冷凍干燥保護劑也是在處理凍干樣品中不可或缺的一步，谷胱甘肽能夠清除掉細胞內的自由基，是一種重要的抗氧化劑，其通過巰基與自由基結合，可直接使自由基還原成酸性物質，從而加速自由基的排泄，并能激活多種酶從而促進糖類、脂肪和蛋白質代謝。

3 冷凍干燥對酶類物質及蛋白質的影響

3.1 冷凍干燥對酶的影響

研究發現細胞內酶的活力決定了細菌的物質、能量代謝和生長速度[27]。而冷凍干燥會導致一些乳酸菌的酶活力顯著降低，如過氧化氫酶、乳酸脫氫酶、磷酸甘油脫氫酶、ATP酶、脂酶等，這會對菌體的活性造成影響，甚至導致其死亡。造成酶活力降低的主要原因是溶質的濃縮效應和細胞的脫水效應。在凍干過程中，水的凍結及蒸發使得細胞間隙內的溶質逐漸被濃縮，電解質的濃度隨之增加，由于細胞內的蛋白質對電解質極為敏感，尤其是高濃度的電解質存在時會引起蛋白質高級結構的改變[36]，進而導致酶喪失其功能，造成菌種的活力下降[37]。

冷凍干燥會使一些維持胞內pH值的酶類失活[38]。例如，K+-ATPase可以使橫跨膜產生電勢，K+與H+互換，起到維持pH值梯度的作用，而冷凍干燥使K+-ATPase失去了這種作用，破壞了pH值的動態平衡，導致胞內pH值的降低，從而影響了酶的活力。另外，ATP合成酶要通過質子梯度為ATP的合成提供能量[39]；冷凍干燥后這種質子梯度被破壞，ATP合成酶的活力減弱，對菌體細胞的生理功能造成影響。冷凍干燥造成的酶活力降低會影響乳酸菌的生長，通過研究德氏乳桿菌保加利亞亞種的冷凍損傷機制，人們發現受凍菌體的結構損傷引起氨基酸轉運相關的酶活力降低，合成蛋白質的速度變慢，代謝受到影響[2]。冷凍干燥對乳酸脫氫酶也有顯著性的影響，因此可以通過測定乳酸脫氫酶的活力來探究冷凍干燥對酶造成的損傷[40]。Li Chun等[41]指出冷凍過程中乳酸脫氫酶的失活是乳酸菌損傷的一個主要因素。乳酸脫氫酶是乳酸菌代謝的關鍵酶，正常發酵過程中，乳酸脫氫酶催化丙酮酸還原為乳酸，其活力大小反映了菌株的產酸能力和能量代謝能力。

3.2 冷凍干燥對蛋白質的影響

干燥過程會導致由脫水引起的細胞失活[42]，失水會破壞蛋白質與水分子、細胞膜之間的相互作用力，導致維持蛋白質正常三級結構的作用力減弱，酶活力喪失，從而引起蛋白質構象發生改變，使其喪失功能[43]。在凍干細胞內維持一定的水分含量是非常重要的，水分含量過低會導致細胞出現不穩定和失活[44]，但水分殘留過多時會引起細胞死亡。干燥后殘余水分質量分數太高（高于5%），殘留的自由水和細胞的蛋白質相互作用可造成蛋白質特定構象改變，從而影響菌體的凍干存活率。同時凍干產品過高的水分含量會大大降低乳酸菌的儲存穩定性，縮短其儲存期。

3.3 維持酶及蛋白質結構穩定性的措施

當微生物細胞正常生理代謝出現異常時，大量的不利物質積累，這會對細胞內酶活力產生較大影響。為了抑制冷凍干燥過程中酶類物質的失活及蛋白質結構的改變，細胞本身會產生相應的應激反應。低溫條件下產生的冷應激蛋白和蛋白酶能提高酶類物質的活性及蛋白質結構的穩定性，并能維持DNA的超螺旋結構及轉錄、翻譯功能，降低冷凍干燥對乳酸菌的損傷。Sanders等[45]的實驗結果表明，乳酸乳球菌在8 ℃冷應激處理48 h后的存活率比沒有冷處理的高20%。

除了自身應激反應之外，當凍干脫水時，添加含有多羥基結構的保護劑能夠代替水分子的位置，并以“水化膜”的形式包裹在蛋白表面，從而起到維持蛋白質結構和功能的作用[40]。在干燥和貯藏過程中，保護劑被廣泛用于穩定蛋白質。張玉華等[46]發現海藻糖通過氫鍵能夠作用于蛋白質，代替失去的水與極性基團作用，維持菌體細胞的原有結構和功能，提高菌體的凍干存活率。

4 冷凍干燥對遺傳物質結構穩定性的影響

4.1 冷凍干燥對遺傳物質的作用方式

在冷凍干燥過程中，遺傳物質的損傷是細胞喪失活力的重要因素之一。原核生物的遺傳物質都是以蛋白質包裹DNA的復合形式存在的，冷凍干燥過程會引起蛋白質變性，導致DNA雙螺旋結構的穩定性下降。在冷凍干燥過程中，水分含量的減少會導致溶質濃度增加和電荷變化，使DNA內部堿基對間的疏水作用減弱，影響遺傳物質的穩定性[47]。當相對濕度降到75%時，DNA的雙螺旋結構會發生可逆變化，而相對濕度在65%以下時，DNA的超螺旋結構就會被破壞，從而導致其空間構型發生變化。乳酸菌DNA超螺旋結構穩定性的下降會影響遺傳物質的轉錄、翻譯和DNA復制過程的破壞，進而導致菌種突變體的產生[48]。

干燥脫水過程會造成DNA雙螺旋結構中堿基對間的氫鍵斷裂，而氫鍵斷裂會使DNA的糖苷鍵斷裂，使DNA發生脫嘌呤和脫嘧啶反應，影響核苷酸的組成，導致DNA的修復酶發生錯誤，從而影響蛋白質和酶的活力[49]。同時過度干燥會除去細胞中的自由水、結合水以及結構水，使其表面的親水基團失去保護，直接和外界環境（包括O2）作用，造成DNA的結構出現損傷。

為了探究冷凍干燥后D N A的結構變化，Santivarangkna等[50]利用傅里葉變換紅外光譜技術研究了真空干燥對瑞士乳桿菌細胞的影響，脫水導致的DNA超螺旋結構改變是造成細胞生理損傷的主要原因之一。

4.2 提高遺傳物質抗冷凍穩定性的方法

為了防止DNA結構的改變，菌體細胞在極端不利環境下，會產生冷凍誘導蛋白質，這種蛋白有助于維持DNA超螺旋結構，并且使細胞能更適應低溫下的轉錄與翻譯[51]，從而提高了細胞對冷凍干燥的抵抗力。通過微膠囊包埋也可以維持乳酸菌細胞遺傳物質的穩定性，Hlaing等[52]通過傅里葉變換紅外光譜測定鼠李糖乳桿菌微膠囊細胞的光譜變化，證明微膠囊可以對菌體細胞內的蛋白質和DNA結構起到保護作用。此外Wang Lijun等[53]也證實菊粉微膠囊可以在冷凍干燥過程中對菌體遺傳物質穩定性起到保護作用，并有效地提高了菌體的益生作用和菌種活力。

5 結 語

冷凍干燥過程雖然會引起菌體的失活甚至死亡，但在乳酸菌保存方面依然起到了很大的作用，通過探究乳酸菌的失活機制，并根據菌體的生理生化特點采取恰當的方法可以提高菌株抗冷凍干燥性能。