鮮切西蘭花貯藏期病原菌分離鑒定及植物精油對其抑制效果

黃文部，馬菀笛，文 豪，曾 茜，何靖柳，秦 文*

（四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014）

西蘭花（Brassica oleracea L. var. italica），又稱青花椰菜、綠花菜，具有豐富的營養價值[1]，是一種常見的優質蔬菜。經過鮮切處理的西蘭花細胞破裂、營養物質流失，對微生物抵抗能力下降，導致西蘭花切面褐變、花球黃化等品質下降，從而縮短了貨架期。刁小琴等[2]分離鑒定出西蘭花黑斑病的病原菌為蕓苔生鏈格孢菌（Alternaria brassicicola），與劉毅[3]的鑒定結果相同。接種該菌后，西蘭花花球開始黃化，葉綠素迅速降解，乙烯釋放量和呼吸速率顯著升高，由此可見，病原菌會嚴重影響西蘭花的貯藏品質。

因此，通過一定保鮮技術抑制西蘭花病原菌的生長繁殖，能有效保證鮮切西蘭花貨架期間的貯藏品質。植物精油，也稱揮發油，是一類安全無毒、具有一定抗菌性的天然保鮮劑[4]。研究發現，肉桂、丁香、茴香、牛至、香茅精油對鏈格孢菌有較好的抑制作用，可通過破壞鏈格孢菌細胞膜的完整性和通透性來影響細胞的外滲率，從而抑制菌絲的生長[5-9]。Ayala-Zavala[10]、Feng Wu[11]等也分別發現百里香精油（Thymus vulgaris）和肉桂精油對抑制鏈格孢菌活性有較好的效果。

本實驗對從染病西蘭花表層分離到的微生物進行純化，將純化后的微生物接種于健康西蘭花，進行致病性實驗。對病原菌菌株的內源轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列測序，通過該保守序列的進化樹分析確定病原菌種屬。選用百里香、肉桂、丁香、茴香、牛至和香茅精油進行抑菌性實驗及活體抑菌實驗，旨在為鮮切西蘭花貯藏期天然殺菌保鮮劑的選擇提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西蘭花（品種‘冬至綠’）（Brassica oleracea L.var. italica），采購自雅安市吉選超市。選擇花球整齊、色澤綠、花形好、花蕾小、大小基本一致的健康西蘭花和自然發病的西蘭花，運回四川農業大學食品學院農產品貯藏與加工實驗室，置于4 ℃的冰箱中預冷備用。

肉桂精油、丁香精油、茴香精油、牛至精油、香茅精油和百里香精油 吉安市國光香料廠；UNIQ-10柱式真菌基因組抽提試劑盒、UNIQ柱式DNA膠回收試劑盒上海生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

FR980凝膠成像儀 上海復日科技儀器有限公司；3730測序列分析儀、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Applied BioSystems公司；DYY-5型穩壓穩流電泳儀 北京六一儀器廠；SW-CJ-1F潔凈工作臺 蘇凈集團安泰公司；DNP-9272型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；YXQ.SG41.280手提式壓力蒸汽滅菌器 上海華線醫用核子儀器有限公司；SK8259真菌試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病原菌分離

病原真菌的分離鑒定參考刁小琴[2]、杜小琴[12]等的方法。選取鮮切處理后腐爛變質的切面按照病癥分組，采用組織分離法。剪取病健交接處約2 mm的組織，用體積分數75%的酒精表面消毒10 s后，用無菌水清洗3 次后置于PDA培養基，繼續純化至3 次連續純化過程無其他菌落出現。

1.3.2 致病性實驗

將純化后的濃度為105CFU/mL微生物孢子懸液噴霧接種于鮮切西蘭花上。每組處理約10 朵花球，重復3 次，接種后的西蘭花用厚度為0.021 mm的聚乙烯保鮮膜單層包裝，于25 ℃暗培養（相對濕度為（85±5）%），觀察并記錄發病情況，顯癥后再次分離鑒定并與該組接種的微生物對比，形態學鑒定一致則確定為病原菌。

1.3.3 病原菌ITS序列分析

基因組DNA的提取按SK8259真菌試劑盒操作。測定已確定病原菌的ITS序列，通過進化樹分析確定病原菌種屬，并以此為精油抑菌效果研究奠定基礎。測序所用菌絲于25 ℃條件下預先培養5 d，DNA的提取參照Landschoot等[13]的方法，ITS序列PCR擴增引物為：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。

PCR體系包括10 × buffer（內含Mg2+）2.5 μL、dNTP 1 μL、正向引物10 μmol/L 0.5 μL、反向引物10 μmol/L 0.5 μL，加雙蒸水至25 μL。PCR程序為：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環；72 ℃終延伸10 min，4 ℃終止反應。所得ITS產物在1.0%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，用膠回收試劑盒回收純化，回收純化產物由生工生物工程有限公司進行測序。在GenBank進行比對并收集相關菌種的ITS序列信息，用MEGA 5.02軟件構建進化樹，大致確定病原所屬種屬，為有針對性地選擇抑菌劑提供依據。

1.3.4 抑菌率實驗

抑菌實驗參考杜小琴等[12]的方法，肉桂、丁香、茴香、牛至、百里香和香茅6 種精油在同一含量下（2.00 μL/mL）進行抑菌實驗，以體積分數10%吐溫-80為溶劑，將配制好的1.50 mL 20.00 μL/mL精油溶液與已滅菌的13.50 mL培養基（約50 ℃）混勻之后倒入平板中，制成含有2.00 μL/mL精油的平板，以等體積的吐溫-80為對照，用無菌打孔器在病原菌（培養7 d）平板上打取直徑為6 mm的菌塊放入平板中央，25 ℃條件下培養3 d后用游標卡尺測量菌落直徑，按照下式計算抑制率，選擇抑制率較高的植物精油進行下面的實驗。

1.3.5 體外抑菌實驗

以體積分數10%吐溫-80為溶劑，最后培養基中精油的最終含量為0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 μL/mL。每個平板加入0.5 mL孢子懸浮液（105CFU/mL），均勻涂布后于25 ℃條件下培養2 d，以抑制率100%的最低精油含量為其最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），繼續培養2 d，若仍不長菌，則為最低殺菌濃度（minimal fungicidal concentration，MFC）[14]。以添加體積分數10%吐溫-80組為對照，實驗重復3 次。

1.3.6 植物精油對鮮切西蘭花花球黃化率和切面褐變率的影響

參照致病性實驗對健康西蘭花進行接種，接種后的西蘭花立即噴施精油溶液，于15 ℃下陰干至表面無液體，所選精油含量設置為2 MFC、3/2 MFC、MFC、1/2 MFC（表1），噴施量約為0.4 g/50 g，以體積分數10%吐溫-80噴施處理組作為對照，立即將塑料盒用保鮮膜封閉起來，置于25 ℃培養箱中暗培養，每天統計花球黃化率和切面褐變率，統計3 d，實驗重復3 次。

表 1 體內抑菌實驗分組Table 1 Grouping for in vivo antimicrobial tests

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及鑒定

根據科赫法則，從鮮切處理后腐爛變質的西蘭花切面（圖1A1）分離、純化出2 種霉菌，回接致?。▓D1A2）和再分離純化后，確定西蘭花的病原菌為其中的一種霉菌（霉菌2號），標記為AB01。分離純化后在25 ℃培養8 d的菌落形態見圖1B1、B2，回接致病再分離純化于25 ℃培養8 d的菌落形態見1C1、C2，孢子見圖1B3、C3。

圖 1 西蘭花貯藏期病原菌分離、菌落形態和發病癥狀Fig. 1 Pathogen isolation, colonial morphology, and pathogenic symptom

AB01菌落近圓形，單菌落能擴展至直徑7 cm，邊緣不規則，菌落正面培養4 d內呈灰白色，4 d開始顏色加深，10 d之后為黑褐色，菌落反面培養初為淡黃色而后轉為黑褐色，菌絲為樹枝狀無隔長菌絲，分生孢子呈手雷狀。被感染西蘭花在25 ℃放置1 d，切面出現褐斑，2 d后出現菌絲，以花球尤為明顯，2 d后切面已基本褐變，與自然病變西蘭花癥狀相似。

ITS全序列分析結果表明，該病原菌與鏈格孢菌屬微生物保守序列相似度最高。該病原菌的ITS全序列NCBI登錄號為MF040794。

圖 2 Alternaria alternata AB01和相關菌株的系統進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of Alternaria alternata AB01 and their relative strains

進化樹（圖2）顯示，病原菌AB01與鏈格孢菌（Alternaria alternata）親緣關系較近，與喬木鏈格孢（Alternaria arborescens）、百日菊鏈格孢（Alternaria zinnia）也比較近，與皮思霉（Pithomyces chartarum）、齒毛菌（Chaetomium globosum）親緣關系較遠。因此可以推斷，鮮切西蘭花病原菌AB01為鏈格孢菌。

2.2 植物精油對病原菌的體外抑菌效果

如圖3所示，培養3 d后，所有精油處理組均未見菌絲生長和蔓延，對照組菌絲蔓延，培養3 d時菌落直徑達到（27.58±2.24）mm。由此表明，6 種精油（2 μL/mL）對AB01都具有良好的抑菌效果。

圖 3 植物精油對鮮切西蘭花病原菌AB01的體外抑制效果Fig. 3 In vitro inhibitory effect of plant essential oil on AB01

表 2 植物精油對鮮切西蘭花病原菌AB01的體外抑菌效果Table 2 In vitro inhibitory effect of plant essential oil on AB01

選定6 種精油研究其對AB01的MIC和MFC。實驗結果（表2）表明，對于MIC，肉桂精油（＜0.3 μL/mL）＜茴香精油（0.6 μL/mL）、牛至精油（0.6 μL/mL）＜丁香精油（0.9 μL/mL）、百里香精油（0.9 μL/mL）＜香茅精油（1.2 μL/mL）；對于MFC，肉桂精油（＜0.3 μL/mL）＜牛至精油（0.6 μL/mL）、茴香精油（0.6 μL/mL）＜丁香精油（1.2 μL/mL）＜百里香精油（＞1.8 μL/mL）、香茅精油（＞1.8 μL/mL）。綜合得出，肉桂精油對AB01的體外抑制效果最好，但更加準確的抑菌含量需要進一步實驗。茴香和牛至精油對AB01的體外抑制效果較好，僅次于肉桂精油，香茅和百里香精油效果較差。

肉桂精油組最低含量（0.3 μL/mL）培養4 d仍未長菌，第二輪實驗將肉桂精油的含量設置為0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05 μL/mL，共6 個含量梯度，操作同1.3.5節，進一步實驗結果（表3）表明，肉桂精油對病原菌AB01的MIC和MFC分別為0.05 μL/mL和0.15 μL/mL。

表 3 肉桂精油對鮮切西蘭花病原菌AB01的體外抑菌效果Table 3 In vitro inhibitory effect of cinnamon oil on AB01

2.3 植物精油對病原菌的體內抑菌效果

根據體外抑菌實驗，選取肉桂、茴香和牛至精油，探究三者對接種AB01鮮切西蘭花的花球黃花率和切面褐變率的影響。結果如圖4A、B所示，雷達圖中數據點越接近中心，表示黃化率（褐變率）越低。對比CK1和CK2發現，接種AB01顯著增大了花球黃化率，且CK1組貯藏3 d后，仍然有50%花球黃化，說明影響花球黃化的因素除了AB01，可能還有別的因素（如溫度等）；對比CK2和CK3發現，吐溫-80作為溶劑，對花球黃化率和AB01的致病過程沒有顯著作用。對比肉桂精油組（A1～A4）發現，低含量的肉桂精油（A4）對AB01的抑制效果較差，隨著肉桂精油含量的增加，對AB01的抑制效果增強（表3），但花球黃花率也有增加，說明過高含量（0.30 μL/mL）的肉桂精油會加速西蘭花花球的黃化，這與預實驗中發現的植物精油在一定含量時會造成鮮切西蘭花部分黃化相吻合，肉桂精油以0.15 μL/mL（MFC）效果最佳；茴香精油組（B1～B4）中，B3和B4處理沒有明顯效果，B2（3/2MFC）處理效果最佳，抑菌含量比體外抑制實驗要高一些；牛至精油組（C1～C4）中，含量為0.9 μL/mL和0.6 μL/mL時效果最好，二者差異不顯著（P＞0.05）。

圖 4 精油處理對鮮切西蘭花花球黃化率（A）和切面褐變率（B）的影響Fig. 4 Effect of essential oil treatment on etiolation (A) and browning (B) in fresh-cut broccoli

切面褐變是鮮切西蘭花被AB01侵染的主要表現，因此可用切面褐變率代表發病率，從而反映植物精油的體內抑菌效果。西蘭花接種AB01后于25 ℃培養2 d，切面基本褐變（CK2），而無菌對照組（CK1）切面保持新鮮顏色。對比花球黃化，AB01對于鮮切西蘭花切面褐變的影響更加明顯。對比CK2和CK3發現，吐溫-80對切面褐變沒有顯著作用。對于肉桂精油組（A1～A4），規律與花球黃化率實驗結果相似，最優含量為0.15 μL/mL，培養3 d時，切面褐變率僅為50.00%。對于茴香精油組（B1～B4），培養2 d時，B1和B2處理效果較好，但培養3 d時，4 組西蘭花切面均全部褐變；對于牛至精油組（C1～C4），培養2 d時，4 組精油抑制褐變效果均較好，培養3 d時，4 組西蘭花切面亦全部褐變。因此，從抑制西蘭花切面褐變角度而言，肉桂精油更適合用于鮮切西蘭花的保鮮。綜合花球黃化率和切面褐變率可得，肉桂精油比牛至精油、茴香精油更適合在鮮切西蘭花保鮮上使用。

3 討 論

本實驗研究了不同精油對于鏈格孢菌A B 0 1的抑制效果。6 種植物精油對AB01的MFC以肉桂精油最低（0.15 μL/mL），其次是茴香和牛至精油（0.6 μL/mL），丁香和百里香精油較高，香茅精油最高，為1.2 μL/mL。

對于丁香和百里香精油的實驗結果，楊婷等[15]研究發現百里香酚和丁香酚對鏈格孢菌的抑制效果有限；解淑慧等[16]發現丁香精油可以抑制柑橘采后柑橘鏈格孢（Alternaria citri）和指狀青霉（Penicillium digitatum）的生長。研究發現，在串珠鐮刀菌（Fusarium verticillioides）[14]，細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）、粉紅單端孢霉（Trichothecium roseum）4 種菌中，百里香對細極鏈格孢的抑制效果最差（半抑制濃度43.6 μL/L）[17]，與本實驗研究結果相似，說明百里香精油和丁香精油雖然具有抑菌效果，但對鏈格孢菌的抑制效果有限。紀淑娟等[18]研究發現0.5 μL/mL的香茅精油可以有效抑制鏈格孢菌菌絲生長，與本研究結果（1.2 μL/mL）不同，可能與精油純度和菌種來源有關。

對于肉桂和牛至精油的實驗結果，李亞茹等[19]研究發現肉桂和茴香精油對鏈格孢菌的MIC分別為0.08、1.20 μg/mL；兩種精油都顯著優于卡那霉素對鏈格孢菌的抑制效果（MIC 800 μg/mL）。蔣妮等[20]研究發現0.50 mg/mL的肉桂精油對鏈格孢菌菌絲的抑制率為100%，對孢子萌發率的抑制率高于90%。Kiran等[21]發現肉桂精油的MIC是0.40 μL/mL，高于本實驗結果（0.15 μL/mL），本實驗發現0.30 μL/mL的肉桂精油可以完全抑制AB01的生長，因此進一步實驗得到肉桂精油對AB01的MIC的差異可能與精油純度、菌種來源有關。Zabka等[14]研究發現牛至和百里香精油對鏈格孢菌的MIC分別為0.092 μL/mL和0.146 μL/mL，可見牛至精油的抑菌效果優于百里香精油。Castro等[22]研究植物精油對于火龍果源鏈格孢菌的抑菌效果，肉桂（MIC 250 μg/mL）優于丁香精油（MIC 500 μg/mL）和香茅精油（MIC 1 000 μg/mL），與本研究結果相同。因此，肉桂精油和牛至精油不僅對鏈格孢菌具有良好的抑制效果，對灰葡萄孢菌[23-24]、鐮刀菌[25]、青霉菌[26]和曲霉屬真菌[27]等的抑制效果也均良好，說明肉桂精油和牛至精油具有廣譜抑菌作用。

同時，肉桂精油比牛至精油表現出更強的抑菌效果，與其揮發效果有關，Frankova等[28]研究發現肉桂精油對蘋果源鏈格孢菌的抑菌效果最強（MIC 32 μL/mL），香茅精油最差（MIC 256 μL/mL），與本研究結果一致。但是熱風協同植物精油進行實驗時發現牛至精油表現出更強的抑菌效果（MIC 2 μL/mL）。說明常溫下肉桂精油比牛至精油更易揮發，表現出更強的抑菌效果。同時經肉桂精油處理的西蘭花花球黃化率和切面褐變率也是最低的，證實了AB01能夠加速鮮切西蘭花的腐敗變質，肉桂精油可以通過抑制AB01的生長繁殖進而延緩西蘭花的品質下降。

因此，本實驗從鮮切西蘭花自然感病部位分離出的AB01真菌菌株表現出致病性，通過ITS序列分析和進化樹繪制比對發現病原菌為鏈格孢菌，NCBI登錄號為MF040794，與刁小琴[2]、劉毅[3]等分離鑒定出的病原菌同屬不同種，說明不同地區的西蘭花其病原菌不同，具有一定研究價值。在已知對鏈格孢菌屬有較強抑制作用的6 種精油中，AB01對肉桂精油最敏感，MIC和MFC分別為0.05 μL/mL和0.15 μL/mL，其次是牛至精油和茴香精油?；铙w抑菌實驗中0.15 μL/mL的肉桂精油噴施處理能降低接種AB01菌株西蘭花的花球黃花率和切面褐變率；因此，認為肉桂精油是一種適用于鮮切西蘭花的天然保鮮劑。天然保鮮劑越來越被廣泛應用于鮮切果蔬保鮮，將肉桂精油應用于鮮切西蘭花上，不僅生產操作方便，而且保鮮劑天然安全，具有一定應用價值。