褪黑素處理對采后獼猴桃果實后熟衰老的影響

胡 苗，李佳穎，饒景萍*

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

獼猴桃果實是皮薄汁多的漿果，對乙烯敏感，常溫下易變軟腐爛[1]。低溫冷藏可降低獼猴桃采后的呼吸作用和內源乙烯的生成，有利于保持生理代謝及營養物質的相對穩定，從而延緩獼猴桃果實的后熟和衰老進程，延長貯藏保鮮期[2]。但是僅低溫貯藏對獼猴桃后熟軟化速度的控制效果有限，特別是中華系列品種，貯藏期和貨架期都比美味獼猴桃短，貯藏過程中更容易出現果實腐爛現象[3]。

褪黑素（melatonin，MT）是在動植物體內廣泛存在的一種小分子的神經內分泌激素，主要由松果體分泌，很長一段時間內人們都認為MT是動物專有的一種神經激素[4]，1995年MT首次在植物中被發現[5-6]。近年來的研究表明MT具有清除植物自由基、抗氧化、抗低溫脅迫、延緩植物衰老等功能[7-9]。例如MT可以幫助黃瓜種子和幼苗清除自由基，增強抗氧化能力[10]。外源MT處理菘藍種子[11]和番茄幼苗[12]能降低膜脂過氧化水平，提高抗氧化酶的活力，減輕冷脅迫對幼苗生長過程中的氧化損傷。Wang Ping等[13-14]發現外源MT能通過保護葉綠素、保護光系統Ⅱ、抑制衰老相關基因表達和提高抗氧化能力等，延緩黑暗誘導的離體葉片衰老和干旱誘導的蘋果葉片衰老。MT在植物根、種子、幼苗、葉片上的應用較廣泛，但目前MT處理對采后果實的研究甚少，對采后低溫貯藏獼猴桃果實生理及品質影響的研究還鮮見報道。

本實驗以‘華優’獼猴桃為試材，系統地研究不同濃度MT處理對低溫貯藏條件下采后獼猴桃果實成熟衰老進程的影響，篩選出適宜濃度，以期為探索低溫貯藏條件下獼猴桃品質變化控制的有效途徑提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘華優’獼猴桃果實（可溶性固形物質量分數為6.5%～7.5%）于2016年10月8日采自陜西省周至縣一個管理良好的獼猴桃園。采收后運回西北農林科技大學園藝學院采后實驗室，常溫下自然放置3 h散去田間熱。挑選大小、成熟度一致，且無病蟲害、無機械損傷的果實作試材。

MT 西安熱默爾公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

3K15型高速冷凍離心機 美國Sigma公司；PAL-1手持式糖度計 日本Atago公司；7001型CO2分析儀美國Telaire公司；UV-1800型紫外-可見分光光度計科大中佳公司；BCD-236DT型海爾冰箱 青島海爾股份有限公司；Trace GC Ultra型氣相色譜儀 美國Thermo Scientif i c公司；FT-327型硬度計 意大利TR公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理及測定指標

將挑選后的果實隨機分成5 組，分別用0（對照）、0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L的MT浸泡10 min，每處理3 次重復，每重復用200 個果，然后在室溫下自然晾干，放入（0.0±0.5）℃、相對濕度（90±5）%冷庫中。在處理前隨機取45 個果進行初值測定；之后在對照和處理組果實中每重復固定15 個果實用于測定呼吸速率和乙烯釋放速率；之后每10 d從冷庫每重復中取10 個果用于硬度和色澤的測定，同時取樣用液氮速凍后保存于-80 ℃的超低溫冰箱中；貯藏90 d后隨機取100 個果實用于統計質量損失率和腐爛率，根據以上數據篩選出延緩果實衰老的適宜MT濃度，然后進行淀粉質量分數和淀粉酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）、谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR）活力及抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量的測定；以上每項指標重復測定3 次。

1.3.2 指標的測定

1.3.2.1 硬度的測定

將果實赤道間隔90°的3 點去皮后，用FT-327型硬度計測定，探頭直徑為11 mm，單位為N。

1.3.2.2 色澤的測定

內果皮色度用CR-400型色差計測定，將果實沿赤道橫切后測內果皮色度，L*值代表果肉亮度，能反映果實褐變及成熟衰老程度[15]。

1.3.2.3 質量損失率和腐爛率的測定

質量損失率參照王瑋[16]的方法測定，具體計算見式（1）。

腐爛率參考王玉萍等[17]的方法測定，具體計算見式（2）。

1.3.2.4 呼吸速率和乙烯釋放率的測定

呼吸速率和乙烯釋放速率的測定參照董曉慶等[18]的方法，分別使用7001型CO2分析儀和Trace GC Ultra型氣相色譜儀測定，單位分別是mg/（kg·h）和μL/（kg·h）。

1.3.2.5 淀粉質量分數和淀粉酶活力的測定

淀粉質量分數和淀粉酶活力的測定方法均參考王強[19]的方法，淀粉酶活力以每15 min每克獼猴桃鮮樣中酶催化作用下產生的麥芽糖質量表示，單位為mg/（g·15 min）。

1.3.2.6 SOD、CAT、APX、GR活力和AsA、GSH含量的測定

SOD活力和AsA、GSH含量測定參考曹建康等[20]的方法，以每克果肉1 min的OD560nm值變化反應體系對氮藍四唑光化還原的50%為一個酶活力單位，單位為U/（g·min）；AsA和GSH含量的單位分別為mg/g、（U·mol）/g；CAT活力的測定參照Gao Hui等[21]的方法，以每克果肉1 min OD240nm值變化0.01 為一個酶活力單位，單位為U/（g·min）。

APX活力參照Nakano等[22]的方法并修改，以每分鐘反應體系在290 nm波長處吸光度減少0.01所需酶量為1 個酶活力單位，單位為U/（g·min）；GR活力的測定參照Halliwell等[23]的方法并修改，以每分鐘反應體系在340 nm波長處吸光度減少0.01所需酶量為1 個酶活力單位，單位為U/（g·min）。

1.4 數據處理

采用Excel 2007軟件進行數據處理，并用SigmaPlot 12.5軟件制圖，用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析進行顯著性比較，檢驗的顯著性概率臨界值為0.05。

2 結果與分析

2.1 MT處理對冷藏獼猴桃果實硬度和色澤的影響

圖 1 MT處理對獼猴桃果實冷藏期間硬度（A）和L*值（B）的影響Fig. 1 Effect of melatonin treatment on firmness (A) and L* value (B)of kiwifruits during cold storage

由圖1A可知，隨著貯藏時間的延長，不同濃度MT處理組的獼猴桃果實硬度持續下降，果實硬度下降過程有兩個明顯階段，前50 d呈現快速下降，在50 d后，硬度下降速度變緩。在前60 d時，0.50 mmol/L MT處理組的獼猴桃硬度最小，后30 d時對照組的最小，而在整個貯藏過程中，0.10 mmol/L MT處理組的獼猴桃硬度下降最緩慢；貯藏90 d時，對照組的果實硬度顯著低于MT處理組（P＜0.05），且0.10 mmol/L MT處理組顯著高于其他濃度處理組。

L*值的下降可以直觀地反映果實在貯藏過程中由于色素聚集或是酶促褐變所引起的果肉變暗的程度，L*值越低，代表褐變越嚴重，果實衰老進程越快。如圖1B所示，在不同處理條件下，L*值都隨貯藏時間的延長而持續下降，由此可見，獼猴桃果肉褐變情況隨貯藏時間的延長而加重。在貯藏后期，對照組L*值顯著低于0.10 mmol/L和0.20 mmol/L處理組（P＜0.05）；所以，0.10 mmol/L和0.20 mmol/L MT處理對果肉褐變的抑制作用最明顯。

2.2 MT處理對冷藏獼猴桃果實質量損失率和腐爛率的影響

圖 2 MT處理對獼猴桃果實冷藏90 d后的質量損失率（A）和腐爛率（B）的影響Fig. 2 Effect of melatonin treatment on mass loss percentage (A) and decay incidence (B) of kiwifruits after cold storage for 90 days

獼猴桃果實采收后，失水、物質代謝會使其質量減少，且貯藏過程中果實的失水情況直接關系到果實的新鮮度。由圖2A可見，在貯藏90 d時，對照組的質量損失率最高，達到1.65%，而0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L MT處理組的質量損失率分別比對照組果實降低了24.8%、34.5%、18.1%、12.7%。由圖2B可知，貯藏90 d后對照組果實的腐爛率為8.64%，而0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L MT處理組的腐爛率分別為4.58%、3.36%、5.69%和7.31%，與對照組差異顯著（P＜0.05）。所以，0.10 mmol/L MT處理更有效地抑制了果實水分的散失和腐爛，較好地保持了果實的品質，延緩了果實衰老。

2.3 MT處理對冷藏獼猴桃果實呼吸速率和乙烯釋放率的影響

由圖3A可以看出，低溫貯藏能夠很好控制果實呼吸強度，從常溫移入冷庫后，在貯藏前10 d的過程中，獼猴桃呼吸強度迅速下降，對照組和0.05、0.10、0.20、0.50 mmol/L MT處理組的呼吸強度分別降低了8.9%、14.5%、19.9%、21.3%、22.7%。此后，不同處理組的呼吸強度變化趨勢相似，呈現貯藏10～20 d時快速上升，20 d后平緩下降，呼吸高峰出現在貯藏20 d左右，MT處理組果實呼吸速率峰值顯著低于對照組（P＜0.05）。除0.05 mmol/L MT處理之外，其他3 個濃度處理對呼吸速率抑制均比較明顯，但差異不顯著。

由圖3B可以看出，獼猴桃果實在低溫條件下，初期乙烯釋放很少，大約到貯藏30 d 時，對照組出現明顯乙烯高峰，之后迅速下降；MT處理組果實乙烯釋放速率與對照組呈現相同趨勢，但是乙烯高峰出現比對照組推遲了10 d左右，且乙烯峰值低于對照組20%～60%，這表明MT處理抑制了果實乙烯的生成。各處理中，0.10 mmol/L MT處理對乙烯釋放的抑制效果最顯著（P＜0.05），在整個貯藏過程中乙烯釋放率最低。

由以上所示結果可見，相比其他濃度M T，0.10 mmol/L對延緩獼猴桃果實衰老進程的效果最好，因此，以下的實驗結果，均以0.10 mmol/L MT處理組與對照組進行比較。

圖 3 MT處理對獼猴桃果實冷藏期間呼吸速率（A）和乙烯釋放速率（B）的影響Fig. 3 Effect of melatonin treatment on respiration rate (A) and ethylene production rate (B) of kiwifruits during cold storage

2.4 MT處理對冷藏獼猴桃果實淀粉質量分數和淀粉酶活力的影響

果實的淀粉質量分數在冷藏期間持續下降，在0～50 d下降速率較快，之后變化緩慢，后期穩定在較低水平，而在整個貯藏過程中對照組果實淀粉質量分數顯著低于處理組果實（圖4A）。由圖4B可看出，對照組和MT處理組的淀粉酶活力在貯藏0～10 d時均下降，10 d后總體均呈先升高后降低的趨勢。對照組和MT處理組淀粉酶活力分別在貯藏30 d和40 d時達到高峰，但處理組的峰值比對照組降低了15.5%；且在整個貯藏期間MT處理組的酶活力顯著低于對照組（P＜0.05）。

圖 4 MT處理對獼猴桃果實冷藏期間淀粉質量分數（A）和淀粉酶活力（B）的影響Fig. 4 Effect of melatonin treatment on starch content (A) and amylase activity (B) of kiwifruits during cold storage

2.5 MT處理對冷藏獼猴桃果實SOD和CAT活力的影響

圖 5 MT處理對獼猴桃果實冷藏期間SOD（A）和CAT（B）活力的影響Fig. 5 Effect of melatonin treatment on SOD (A) and CAT (B) activity of kiwifruits during cold storage

從圖5A中可以看出，MT處理組與對照組果實SOD活力的變化趨勢基本一致，剛入冷庫時活力處于較低水平，之后呈迅速上升的趨勢，處理組和對照組均在貯藏40 d時達到高峰，然后下降，但處理組果實的SOD活力高峰比對照組高13.05%，且貯藏10 d后，MT處理組果實SOD活力一直顯著高于對照組（P＜0.05）。圖5B顯示，獼猴桃果實的CAT活力在開始時較低，隨著貯藏時間的延長逐漸上升，MT處理組和對照組果實在采后第40天CAT活力均達到高峰，之后又下降，但處理組的CAT活力峰值高于對照組17.6%，二者差異顯著（P＜0.05）。

2.6 MT處理對冷藏獼猴桃果實AsA和GSH含量的影響

如圖6A所示，對照組和MT處理組獼猴桃果實的AsA含量在貯藏期間呈先下降后上升再下降的趨勢，且在貯藏10 d后，處理組果實的AsA含量一直顯著高于對照組（P＜0.05）。由圖6B可看出，對照組和MT處理組果實的GSH含量在貯藏期間變化趨勢基本一致，即在貯后不斷上升，于40 d時達到高峰，而后開始下降，且在整個貯藏過程中，與對照組相比，MT處理顯著提高了獼猴桃果實的GSH含量（P＜0.05）。

圖 6 MT處理對獼猴桃果實冷藏期間AsA（A）和GSH（B）含量的影響Fig. 6 Effect of melatonin treatment on the contents of AsA (A) and GSH (B) content in kiwifruits during cold storage

2.7 MT處理對冷藏獼猴桃果實APX和GR活力的影響

圖 7 MT處理對獼猴桃果實冷藏期間APX（A）和GR（B）活力的影響Fig. 7 Effect of melatonin treatment on APX (A) and GR (B) activity of kiwifruits during cold storage

如圖7A所示，對照組和MT處理組獼猴桃果實的APX活力在貯藏后急劇升高并在第20天達到高峰，此時MT處理組果實APX活力比對照組高7.2%；且在此后MT處理組果實的APX活力也一直顯著高于對照組（P＜0.05）。由圖7B可看出，對照組和MT處理組果實的GR活力在貯藏期間變化趨勢基本一致，即在貯后前期不斷上升，于40 d時達到高峰，而后開始下降。自30 d后，整個貯藏期間MT處理顯著提高了獼猴桃果實的GR的活力（P＜0.05）。

3 討 論

蔡慧[24]、郭葉[25]、李盼盼[26]、康孟利[27]等研究表明，在低溫貯藏條件下，獼猴桃果實衰老伴隨著果實硬度和色度的下降，質量損失率和腐爛率的上升，以及呼吸高峰和乙烯釋放高峰的出現。在本實驗中發現，在對照組與處理組的乙烯釋放增加時期，果實硬度迅速下降，因此乙烯的釋放加速了果實軟化；與對照相比，0.10 mmol/L MT處理延緩了乙烯釋放高峰的出現，并降低了其和呼吸高峰的峰值，更有效地延緩了硬度和色度的下降，降低了質量損失率和腐爛率的發生。這些結果表明0.10 mmol/L MT處理延緩了獼猴桃果實的衰老，提高了果實的品質。MT是松果體中產生的一種吲哚胺類分子，具有調節睡眠、延緩衰老、調節免疫、抑制腫瘤等多項生理功能，被認為是一種具有廣泛應用前景的生物激素，已被美國食品藥物管理局批準，可作為膳食補充劑使用，我國衛生部也批準MT可應用于保健品中[28]；因此，在獼猴桃上使用限定濃度的MT處理也是安全健康的。MT在植物體內可能起到類似于生長調節劑的生理功能，低濃度促進植物生長，高濃度抑制生長。Murch[29]、Sarropoulou[30]等研究表明改變植物體內的MT濃度會對根的生長發育產生影響，低濃度可以促進側根以及不定根的生長，高濃度則抑制。Posmyk等[31]研究發現低濃度的MT溶液可以明顯提高種子萌發率，高濃度則是抑制效果。包宇[32]以番茄幼苗為對象進行實驗時，發現以100～150 μmol/L MT處理的低溫保護效果較好；而在250 μmol/L時，各項生長生理指標都顯著低于對照組，說明高濃度的處理反而加重低溫傷害。本實驗中，0.10 mmol/L MT起到的促進作用更好，0.05 mmol/L和0.20 mmol/L MT起到的促進作用非常接近，次于0.10 mmol/L，而0.50 mmol/L MT的促進作用不顯著。因此，在對采后獼猴桃進行處理實驗時，MT濃度的選擇很重要。現階段MT在植物種子、幼苗上的研究較多，在果實上的研究卻鮮有報道，其中在植物油菜葉片[33]、水稻葉片[34]、擬南芥葉片[35]上，也證明了MT具有延緩衰老的作用；在果實中，Gao Hui等[21]研究表明0.1 mmo/L MT處理具有延緩桃果實衰老的作用。而在孫倩倩[36]的研究中發現外源MT處理綠熟期番茄果實后，能夠促進番茄果實的成熟，并能提高其品質，這可能與不同成熟期的不同物種所受MT影響不同有關。

淀粉酶催化淀粉水解，有學者研究獼猴桃果實軟化衰老時發現，淀粉的降解是獼猴桃果實軟化衰老的主要原因之一[37]。本實驗0.1 mmol/L MT處理降低了淀粉酶活力，從而減少了淀粉的降解，延緩了果實的衰老。Wang Ping等[38]研究表明MT可以通過提高植物葉片的淀粉、蔗糖等光合產物的代謝變化延緩植物衰老。研究表明，衰老的獼猴桃伴隨著自由基水平的升高[39]；而果實體內可以通過SOD、CAT和AsA-GSH循環系統的作用降低活性氧對自身的傷害作用[40]。AsA-GSH是果實體內直接清除活性氧的酶促系統，APX和GR是此系統的關鍵酶，可以保持果實體內抗氧化物質AsA和GSH的平衡[41]；而MT是一個自由基清除劑和廣譜的抗氧化劑[42]。Wang Ping等[43]通過研究不僅發現MT顯著提高了SOD和CAT活力，其研究結果也表明了MT是參與調控AsA-GSH循環系統的關鍵酶，如提高APX活力和GR活力。

綜上所述，0.1 mmol/L MT處理可以降低乙烯釋放速率和呼吸強度，推遲乙烯釋放高峰，降低淀粉酶活力，提高抗氧化酶SOD、APX、GR等的活力，提高CAT活力峰值，提高AsA和GSH的含量，延緩淀粉的降解和果實硬度下降，從而延緩了獼猴桃果實的后熟衰老進程。