生姜提取物對苯并芘染毒小鼠Ⅱ相酶的誘導作用及對Nrf2-Keap1通路的影響

高增明，馬冉冉，劉步云，王永麗*，王 斌，李大鵬，李 鋒*

（山東農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，山東省高校食品加工技術與質量控制重點實驗室，山東 泰安 271018）

生姜是姜科姜屬草本宿根植物，在中國及東南亞地區(qū)被廣泛用作傳統(tǒng)的調味料和藥材。生姜提取物及其成分具有多種生物活性及藥理學作用，如抑菌消炎、抗氧化、止嘔、抗運動病等[1,2]。最新研究表明，生姜提取物能夠有效緩解黃曲霉毒素B1導致的氧化損傷及肝臟毒性[3]，以及毒死蜱導致的大鼠腦、子宮氧化損傷[4]，作用機理或與姜酚類成分激活核轉錄因子E2相關因子2（nuclear factor (erythroid-derived 2)-like 2，Nrf2）-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch like ECH associated protein 1，Keap1）信號通路有關[5]。因此，研究生姜功能成分的生物及藥理學活性，對于理解生姜的營養(yǎng)健康作用及開發(fā)新型的生姜源功能食品或藥品具有重要意義。

苯并芘（benzo[α]pyrene，BαP）是一種強致癌多環(huán)芳烴類化合物。BαP本身毒性較低，但經(jīng)細胞色素P450酶系催化后，會形成強致癌代謝物——BαP-7,8-二羥基-9,10-環(huán)氧化物（BαP-7,8-dihydroxy-9,10-epoxide，BPDE），同時產(chǎn)生大量活性氧自由基，對DNA和蛋白質等大分子物質造成損傷[6-7]。在BαP代謝過程中，抗氧化酶和Ⅱ相酶構成了機體質量要的防御體系，它們能夠抑制BPDE的形成[8-9]。前期以生物活性為導向，采用鼠肝癌Hepa1c1c7模型發(fā)現(xiàn)生姜中某些成分是很強的Ⅱ相酶誘導子[10]，而且該活性受生姜品種的影響[11]。進一步通過細胞活性分析對31 種全國各地生姜的Ⅱ相酶誘導潛力進行了篩選，發(fā)現(xiàn)廈門同安土姜誘導能力最強[11]。因此，本研究擬進一步采用BαP染毒小鼠模型，研究上述提取物對抗氧化酶、Ⅱ相酶活力以及Nrf2-Keap1信號通路的影響，以期從體內(nèi)角度揭示生姜對外源性致癌物的解毒作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

廈門同安土姜（Zingiber oきcinale Roscoe）由山東省萊蕪市農(nóng)科院提供。4 周齡SPF級昆明雄性小鼠由山東泰邦生物研究所提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）2013-0006。

BαP（純度＞96%） 美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、谷胱甘肽硫轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）試劑盒南京建成生物工程研究所；血氧合酶1（hemooxygenase 1，HO-1）試劑盒、醌氧化還原酶（quinone reductase，QR）試劑盒 上海邦奕生物科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白測定試劑盒 上海碧云天生物技術中心；Nrf2、Keap1單克隆抗體 美國CST公司；SYBR premix EX Taq Kit 日本Takara公司。

1.2 儀器與設備

TDL-50B 低速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠；Avanti J-30I高速離心機 美國Beckman Coulter公司；UV-5500紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司；SpectraMax M2 多功能酶標儀 美國MD公司；LC-LTQ Orbitrap XL MS/MS液相色譜-質譜聯(lián)用儀美國Thermo Fisher公司；1260高效液相色譜系統(tǒng)（配有二極管陣列檢測器） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 生姜提取物的制備

樣品洗凈、晾干，切成絲狀，按料液比1∶10（m/V）用無水乙醇索氏提取4 h。重復提取3 次，過濾并合并濾液。真空旋轉蒸發(fā)濃縮成膏狀，然后取50 g溶于500 mL水中，加入等體積的乙酸乙酯充分振蕩分層，取乙酸乙酯層，重復5～6 次。然后旋轉蒸發(fā)去除有機試劑，得到生姜提取物，經(jīng)計算得率為3.51%。

1.3.2 動物飼養(yǎng)與處理

35 只小鼠適應性飼養(yǎng)一周后，按體質量隨機分為5 組，每組7 只動物：對照組（CK）、BαP處理組（BαP）、低劑量生姜組（100 mg/（kg·d），BαP+LG）、中劑量生姜組（200 mg/（kg·d），BαP+MG）及高劑量生姜組（400 mg/（kg·d），BαP+HG）。生姜提取物劑量按體質量計，溶于玉米油后灌胃，對照組和BαP組給予同等體積的玉米油，連續(xù)飼養(yǎng)14 d。最后一次灌胃后禁食2 h，除對照組外，其余組分別腹腔注射50 mg/kg BαP。禁食24 h后，各組小鼠稱質量，眼眶取血。采用斷頸法處死小鼠，解剖摘取肝臟和腎臟，濾紙吸干，稱質量，計算臟體比。

1.3.3 血清及組織勻漿的制備

血液在4 ℃、3 000×g離心3 min，收集上清液，即為血清。取一定質量的器官組織，按照1∶9（m/V）的比例加入生理鹽水，在冰上手動勻漿，勻漿液在4 ℃、3 000×g離心10 min，取上清液，即10%的組織勻漿。組織勻漿在4 ℃、14 000×g離心30 min，取上清液即為細胞漿。

1.3.4 抗氧化酶和Ⅱ相酶活力的測定

血清及組織勻漿中抗氧化酶CAT、GPx、SOD及GST活力，按照南京建成試劑盒說明測定；Ⅱ相酶QR、HO-1活力按照試劑盒說明測定。

1.3.5 Nrf2及Keap1蛋白表達測定

采用BCA法測定樣品蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）。將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。室溫封閉1 h后，加入相應一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3 次，每次15 min，然后加入二抗（1∶2 000稀釋）孵育2 h后，再次用TBST洗膜3 次，每次15 min。最后，采用電子化學發(fā)光顯影，暗室曝光。

1.3.6 Ⅱ相酶及Nrf2、Keap1基因表達測定

取出凍存組織，加入TRIzol充分勻漿，終質量濃度100 mg/mL，室溫放置5 min，然后于4 ℃、14 000×g離心5 min，取上清液，按照動物組織總RNA提取試劑盒說明書提取RNA樣品。參照報道的方法合成Nrf2、Keap1及Ⅱ相酶的引物（表1）[12]。參照熒光定量試劑盒SYRB Green法說明書，進行去除基因組DNA反應、反轉錄以及實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）檢測。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，40 個循環(huán)，反應體積20 μL。以GADPH為內(nèi)參基因，計算基因表達的相對變化。

表 1 主要Ⅱ相酶及Nrf2、Keap1基因的引物序列Table 1 Primers used for qPCR analysis of phase II enzyme genes,Nrf2 and Keap1

1.3.7 液相色譜-質譜分析條件

色譜條件：色譜柱H y p e r s i l G O L D C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱溫40 ℃，流動相為水（含0.2%甲酸，A）和乙腈（B），梯度洗脫程序：0～5 min，3% B；5～30 min，3%～35% B；30～40 min，35%～95% B；40～47 min，95% B；47～47.2 min，95%～3% B；47.2～53 min，3% B；流速0.5 mL/min，進樣量10 μL，DAD檢測器（掃描波長200～600 nm）。

質譜條件：負離子電噴霧離子源，電壓4.1 kV，毛細管溫度300℃，鞘氣壓力35 kPa，輔助氣壓力10 kPa，質量掃描范圍m/z 200～600。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 生姜提取物對BαP染毒小鼠體內(nèi)抗氧化酶活力的影響

在實驗期間，全部35 只小鼠均存活良好，沒有動物死亡現(xiàn)象出現(xiàn)，表明實驗中使用的生姜提取物灌胃濃度及BαP注射劑量均無致死作用。

表 2 生姜提取物對BαP染毒小鼠體內(nèi)抗氧化酶活力的影響（n＝ 7）Table 2 Effect of ginger extract on antioxidant enzyme activities in mice exposed to BαP (n= 7)

由表2可知，與對照組相比，BαP處理對小鼠血清、肝和腎臟中CAT和GSH-Px活力無顯著影響（P＞0.05），但極顯著提升了肝臟中SOD活力（P＜0.01）。經(jīng)生姜提取物連續(xù)灌胃14 d后，不同劑量的生姜提取物表現(xiàn)出對抗氧化酶活力不同的影響。與BαP處理組相比，低劑量處理顯著提升了肝臟中CAT活力（P＜0.05）；中劑量處理極顯著提高了血清中GSH-Px活力（P＜0.01）、肝臟中CAT、SOD和GSH-Px活力以及腎臟中CAT和GSH-Px活力（P＜0.01）；高劑量灌胃則對血清、肝臟和腎臟中CAT活力影響最為顯著（P＜0.01），對其他抗氧化酶無影響（P＞0.05），與BαP處理組相比，CAT活力分別提高了76.0%、15.4%和70.3%。

2.2 生姜提取物對BαP染毒小鼠體內(nèi)Ⅱ相酶的影響

2.2.1 Ⅱ相酶活力變化

圖 1 生姜提取物對BαP致毒小鼠肝臟和腎臟中Ⅱ相酶活力的影響Fig. 1 Effect of ginger extract on phase II enzyme activities in liver and kidney of mice exposed to BαP

如圖1所示，與對照組相比，BαP處理均極顯著刺激了肝臟中3 種主要Ⅱ相代謝酶的活力（P＜0.01），以及腎臟中GST和HO-1的活力，對QR活力無顯著影響（P＞0.05），這可能與肝臟是體內(nèi)主要的解毒器官有關[13]。當BαP進入機體后，激活了Ⅱ相酶的表達機制，提高酶的活性以抵抗外界異生物質。相比于BαP處理組，不同劑量的生姜提取物灌胃14 d能極顯著提高肝臟和腎臟中QR、GST和HO-1的活力（P＜0.01），并且對肝臟與腎臟中QR和HO-1的活力具有顯著的劑量誘導效應。BαP+HG處理組肝臟中QR和HO-1的活力分別提高了29.05%和56.39%，腎臟中QR和HO-1的活力分別提高了26.93%和57.22%。中劑量處理對小鼠肝臟和腎臟中GST活力誘導效果最明顯。

2.2.2 Ⅱ相酶mRNA表達變化

圖 2 生姜對BαP致毒小鼠肝臟和腎臟中Ⅱ相酶mRNA表達的影響Fig. 2 Effect of ginger extract on mRNA expression of phase II enzymes in liver and kidney of mice exposed to BαP

為進一步探討生姜提取物對BαP染毒小鼠Ⅱ相酶的誘導效應，采用qPCR技術從基因表達方面分析了小鼠肝臟中NQO1、GST和HO-1 mRNA的變化情況（圖2）。與對照組相比，BαP處理極顯著提高了GST和HO-1 mRNA的相對含量（P＜0.01），分別增加了39%和33%。與BαP處理相比，不同劑量的生姜處理對小鼠肝臟中NQO1和HO-1 mRNA的表達具有極顯著的劑量誘導效應（P＜0.01）；中劑量處理對肝臟中GST mRNA的表達具有極顯著誘導作用（P＜0.01），與BαP處理組相比，提高了58.2%。結果與Mohamed等[14]研究一致。他們發(fā)現(xiàn)生姜提取物和乙酸鉛共同處理能顯著提高GST-α1（1.4 倍）、GPx1（1.8 倍）和CAT（8 倍）mRNA的表達。

2.3 生姜提取物對BαP染毒小鼠肝臟Nrf2-Keap1信號通路的影響

圖 3 生姜提取物對BαP致毒小鼠肝臟中Nrf2-Keap1蛋白表達的影響Fig. 3 Effect of ginger extract on protein expression of Nrf2-Keap1 in liver of mice exposed to BαP

如圖3所示，與對照組相比，BαP處理組Nrf2的蛋白表達水平增加了14.1%（P＜0.01），Keap1蛋白的表達降低了48.6%（P＜0.01）。經(jīng)不同劑量的生姜提取物喂養(yǎng)后，肝臟中Nrf2蛋白表達水平極顯著升高（P＜0.01），與BαP處理組相比，低、中、高劑量組分別增加了6.14%、21.9%和9.6%；同時，Keap1蛋白表達水平極顯著下降（P＜0.01），分別降低了8.2%、34.7%和13.1%。

圖 4 生姜提取物對BαP致毒小鼠肝臟中Nrf2-Keapl mRNA表達的影響Fig. 4 Effect of ginger extract on mRNA expression of Nrf2-Keap1 in liver of mice exposed to BαP

由圖4可知，與對照組相比，BαP處理能極顯著提高Nrf2 mRNA的表達（提高15.8%），降低Keap1 mRNA的表達（降低12.3%）（P＜0.01）。而經(jīng)不同劑量的生姜提取物連續(xù)灌胃14 d后，與BαP處理組相比，低、中和高劑量組Nrf2 mRNA表達水平分別提高了38.3%、199.1%和121.7%（P＜0.01），Keap1 mRNA的表達水平分別降低了12.5%、33.5%和28.5%。Nrf2與Keap1的動態(tài)平衡對于Keap1-Nrf2信號通路至關重要。

2.4 生姜提取物的成分鑒定

為進一步明確生姜提取物對BαP染毒小鼠抗氧化酶及Ⅱ相酶誘導作用的物質基礎，采用LC-LTQ Orbitrap XL MS/MS對生姜提取物的主要成分進行了鑒定。

圖 5 生姜提取物總離子流圖Fig. 5 Total ion current chromatogram of ginger extract

生姜提取物成分鑒定總離子流圖見圖5。根據(jù)總離子流圖出峰時間、MS/MS數(shù)據(jù)以及相關文獻報道，共鑒定出19 種主要的生姜成分（表3）。由于缺乏相應的商業(yè)化標品，當前并沒有對這些成分進行定量分析。在鑒定的這些成分中，大多屬于姜酚類物質。

表 3 生姜提取物LC-LTQ Orbitrap XL MS/MS鑒定結果Table 3 Identi fication of chemical compounds in ginger extract by LC-LTQ Orbitrap XL MS/MS

3 討 論

BαP作為一種強致癌性多環(huán)芳烴類化合物，廣泛存在于環(huán)境中，如汽車尾氣、石化工業(yè)廢氣、吸煙煙氣、煙熏及燒烤肉制品等[13]。研究表明，BαP的高致癌性主要源于其在體內(nèi)代謝轉化過程中生成的高活性中間代謝產(chǎn)物BPDE[6]；同時，該過程也會刺激大量ROS的產(chǎn)生，造成對蛋白質和DNA等生物大分子的氧化損傷[7]。因此，在BαP的體內(nèi)代謝解毒過程中，Ⅱ相酶和抗氧化酶發(fā)揮了重要的角色[8-9]。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)生姜提取物連續(xù)灌胃14 d后，不同劑量的生姜提取物對BαP染毒小鼠的抗氧化酶活力影響不同。與BαP損傷組相比，中劑量灌胃組和中劑量灌胃組顯著誘導小鼠血清中CAT和GSH-Px活力及肝腎中CAT、SOD和GSH-Px的活力（P＜0.05）。本實驗結果與前人研究結果一致。姜衛(wèi)星[15]研究了生姜醇提取物對大鼠肝臟缺血再灌注損傷的影響，發(fā)現(xiàn)生姜提取物能顯著提高CAT和SOD的活力。Kota等[16]研究發(fā)現(xiàn)用5%生姜粉喂養(yǎng)30 d可顯著影響大鼠肝臟中CAT、SOD和GPX的活力，與對照組相比，酶活力分別提高了94%、141%和30%。El-Sharaky等[17]也發(fā)現(xiàn)用100 mg/（kg·d）的生姜提取物能顯著緩解溴苯導致的大鼠肝臟中GPx和SOD活力的降低。這些結果表明，生姜提取物在一定程度上能提高BαP染毒小鼠機體內(nèi)抗氧化酶活力。

BαP等外源性有毒物質進入機體會經(jīng)過Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝。在細胞色素P450酶催化的Ⅰ相代謝反應中，BαP會由無活性的前致癌物活化為強致癌代謝物-BPDE，這些物質進一步在QR、GST和HO-1等Ⅱ相代謝酶的催化下解毒并排出體外[6-7]。因此，誘導Ⅱ相代謝酶的表達，可以有效保護機體免受外源毒性物質和活性氧的損傷，這也被認為是許多植物化學成分發(fā)揮化學預防作用的重要機制[18]。相比于BαP處理組，連續(xù)灌胃14 d后，不同劑量的生姜提取物灌胃14 d能極顯著提高肝臟和腎臟中QR、GST和HO-1的活力（P＜0.01），并且對肝臟與腎臟中QR和HO-1的活力具有顯著的劑量誘導效應。類似的結果在前人研究中也有報道。Nirmala等[19]研究表明，1%和5%的生姜化合物能顯著提高BαP誘導的肝臟和腎臟中QR和GST活力。Li Feng等[20]也發(fā)現(xiàn)生姜中6-脫氫姜烯酚和1-脫氫-6-姜二酮等成分具有顯著誘導小鼠肝癌Hepa1c1c7細胞中NAD(P)H：醌氧化還原酶的潛力。并且，RT-PCR檢測結果也表明生姜提取物對小鼠肝臟中NQO1、GST和HO-1 mRNA的影響結果與Ⅱ相酶活力變化結果基本一致，進一步證實了生姜提取物可以從酶活和轉錄兩方面對BαP染毒小鼠肝臟和腎臟中的Ⅱ相酶發(fā)揮誘導作用。

在機體應對外界氧化和化學物質等導致的氧化應激反應中，Nrf2-Keap1/抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路被認為是機體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號通路[21]。在生理狀態(tài)下，Nrf2的Neh2結構域和Keap1蛋白的BTB結構域和C-端的Kelch重復單元結合，并且錨定于細胞漿中的肌動蛋白上；當受氧化刺激時，Nrf2-Keap1復合物解離，Nrf2由細胞質向細胞核內(nèi)轉移，并且與ARE以及Maf蛋白結合，從而啟動ARE-編碼的Ⅱ相酶基因以及某些抗氧化酶基因的轉錄[22-23]。為探討生姜提取物對抗氧化酶和Ⅱ相酶的誘導機制，進一步分析了Nrf2和Keap1蛋白及mRNA表達變化。結果表明，生姜提取物對Ⅱ相酶的誘導作用與其對Nrf2-Keap1/ARE信號通路的激活有關。不同劑量的生姜提取物可從蛋白表達和mRNA相對含量水平兩方面上調肝臟內(nèi)Nrf2和抑制Keap1表達。Bak等[24]也證實，富含6-姜烯酚的生姜提取物能夠顯著誘導細胞和小鼠肝臟Nrf2蛋白的表達，同時能夠提高HO-1、CAT等抗氧化酶的活力。進一步分析了處理前后Nrf2/Keap1相對比例變化，發(fā)現(xiàn)與對照組和BαP組相比，生姜提取物處理極顯著提高了Nrf2/Keap1相對含量（P＜0.01），表明它們確實從轉錄層面激活了Nrf2-Keap1/ARE信號通路。

最后，采用LC-LTQ Orbitrap XL MS/MS對生姜提取物的主要成分進行了鑒定。鑒定出的19 種成分大多屬于姜酚類物質。研究表明，很多姜酚類成分具有化學預防作用及抗氧化應激作用。如姜黃素被證實具有抗氧化、抗腫瘤及抗突變等作用[25-27]，其對多種腫瘤的化學預防作用與其較強的Ⅱ相酶誘導能力密切相關[28]，構效關系分析表明其活性主要與β-二酮官能團有關。姜黃素對BαP誘導的人肺上皮細胞BEAS-2B的損傷也具有保護作用[29]。6-脫氫姜烯酚[30]、6-姜烯酚和1-脫氫-6-姜二酮[20]在人肝癌HepG2細胞和小鼠肝癌Hepa1c1c7等多種細胞評價體系中，均表現(xiàn)出較強的Ⅱ相酶誘導潛力。

4 結 論

本研究探討了生姜提取物對BαP染毒小鼠主要抗氧化酶及Ⅱ相酶的影響，并基于Nrf2-Keap1/ARE信號通路分析了可能的調控機制。結果表明，生姜提取物處理能顯著誘導BαP致毒小鼠血清中CAT和GSH-Px活力及肝腎中CAT、SOD和GSH-Px的活力。同時，顯著提升動物肝臟中QR、HO-1和GST等Ⅱ相酶的活力。生姜提取物可從蛋白表達和基因轉錄兩方面提高Nrf2的表達以及抑制Keap1表達。最后，采用高效液相色譜-軌道離子阱質譜聯(lián)用方法從提取物中鑒定得到19 種成分。以上研究結果表明，生姜提取物能夠通過誘導體內(nèi)抗氧化酶和Ⅱ相酶的表達，緩解BαP對機體的氧化損傷，這為進一步以生姜為原料開發(fā)相關的功能食品或藥品提供了參考。