小米抗氧化肽的純化及其抑制H2O2誘導(dǎo)損傷的胰島素瘤細胞氧化應(yīng)激作用

王 帥，劉劍利，霍雅鵬，閻 笑，田思琪，賀 音，曹向宇*

（遼寧大學(xué)生命科學(xué)院，遼寧 沈陽 110036）

抗氧化肽是一類具有抗氧化作用的生物活性肽，由于其具有較小的分子質(zhì)量和較高的活性而被廣泛研究[1]。目前，研究者已經(jīng)從玉米、小麥、大豆、花生等多種谷物及油料作物種子蛋白中制備和純化了抗氧化肽，多數(shù)研究通過體外實驗評價多肽的抗氧化能力[2-5]，而對于多肽在細胞及動物水平的抗氧化作用研究較少。通過細胞水平的抗氧化研究可以確定抗氧化肽的生物學(xué)功能，為其進一步的應(yīng)用提供依據(jù)。

氧化應(yīng)激是機體自由基產(chǎn)生和清除動態(tài)平衡被破壞，或外源性氧化活性物質(zhì)過量攝入導(dǎo)致活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）在體內(nèi)堆積而產(chǎn)生的細胞毒性作用[6-7]。過多的自由基會損傷細胞內(nèi)的蛋白、脂質(zhì)和DNA，還會誘發(fā)細胞凋亡等細胞損傷作用[8]。氧化應(yīng)激與2型糖尿病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。研究表明，糖尿病患者體內(nèi)高血糖、高血脂病理條件下，細胞代謝過程中會產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致ROS的積累[10]。由于胰島素瘤細胞的抗氧化酶系表達水平較低，胰島β細胞對ROS敏感，容易受到氧化損傷[11]。因此，胰島素瘤細胞是良好的驗證多肽體內(nèi)抗氧化活性的細胞模型。目前，利用各種天然抗氧化劑保護胰島β細胞免于氧化應(yīng)激損傷從而預(yù)防和治療糖尿病受到人們的廣泛重視，成為研究的熱點[12]。

本課題組前期的研究中制備了小米抗氧化肽，并進行了體外抗氧化活性的檢測，結(jié)果表明小米抗氧化肽具有良好的自由基清除能力和體外抗氧化活性[13]。本研究利用凝膠過濾與離子交換層析相結(jié)合的方法對小米抗氧化肽進行分離純化，利用還原力測定不同組分的抗氧化能力，利用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基和羥自由基清除能力實驗檢測其對自由基清除能力。利用H2O2模擬細胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)，利用大鼠胰島素瘤細胞（INS-1）進行小米抗氧化肽抑制細胞氧化應(yīng)激作用研究，以期為小米抗氧化肽抑制胰島細胞氧化應(yīng)激和功能減退作用提供實驗依據(jù)，為使其更廣泛地應(yīng)用于食品和保健品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米抗氧化肽由遼寧大學(xué)生命科學(xué)院實驗室制備；INS-1細胞由遼寧大學(xué)生命科學(xué)院實驗室保存；2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）、DPPH、Sephadex G-25 美國西格瑪奧德里奇公司；DEAE-32纖維素 英國沃特曼有限公司；3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 上海起發(fā)實驗試劑有限公司；DMEM培養(yǎng)基 美國海克隆公司；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；Annexin-V/FITC凋亡檢測試劑盒 凱基生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BS223S電子分析天平 德國賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；JW-3021HR高速冷凍離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司；DP73熒光倒置顯微鏡 日本OLYMPUS公司；721N可見分光光度計 上海精密科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；Sunrise全自動酶標儀 瑞士帝肯公司；FACS Calibur流式細胞儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（美國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小米抗氧化肽的制備

小米抗氧化肽參照課題組前期研究的方法進行制備[13]。冷凍干燥后配制成1 mg/mL溶液，用于進一步分離純化。1.3.2 小米抗氧化肽的分離純化

1.3.2.1 Sephadex G-25柱層析

采取自然沉降法裝柱，柱床體積3 cm×70 cm，用50 mmol/L pH 8.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）平衡后上樣2 mL，流速為0.5 mL/min，280 nm波長處檢測吸光度，每管2 mL收集洗脫液，分別根據(jù)還原力測定各組分的抗氧化活性，收集活性組分，濃縮后用于進一步純化。

1.3.2.2 離子交換層析

將處理好的DEAE-32懸浮于50 mmol/L、pH 8.0 PBS中，自然沉降法裝柱，柱床體積為3 cm×50 cm，平衡后備用。將Sephadex G-25柱層析收集的活性組分上樣，上樣量2 mL，用含0.1 mol/L NaCl和0.5 mol/L NaCl的平衡緩沖液進行分段洗脫，流速為0.5 mL/min，280 nm波長處檢測吸光度，分管收集，每管2 mL，根據(jù)還原力測定各組分的抗氧化活性，收集活性峰，冷凍干燥，-20 ℃保存。

1.3.3 純度鑒定

采用醋酸纖維素薄膜電泳法進行純度鑒定[14]。

1.3.4 還原力測定

還原力參考文獻[15]的方法進行測定，于700 nm波長處測定吸光度，反應(yīng)物的吸光度越大表明還原力越強。

1.3.5 自由基清除能力測定

DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基清除率參照參考文獻[16-17]進行測定。

1.3.6 細胞培養(yǎng)

INS-1細胞于37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.3.7 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞存活率的影響

將INS-1細胞接種到96 孔板中，每孔200 μL，向其中加入純化后的小米抗氧化肽（質(zhì)量濃度依次為10、20、30、40、50 μg/mL）預(yù)處理1 h，再加入終濃度0.5 mmol/L的H2O2，對照組不作任何處理，H2O2組僅加入0.5 mmol/L H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT法檢測細胞存活率。

1.3.8 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞內(nèi)ROS的影響

參考劉曉等[18]的方法。將INS-1細胞進行種板，貼壁后使用終質(zhì)量濃度50 μg/mL小米抗氧化肽預(yù)處理1 h，再加入終濃度0.5 mmol/L的H2O2處理，同時設(shè)置對照組（不作任何處理）和H2O2組（僅加入0.5 mmol/L H2O2），培養(yǎng)24 h后除去細胞培養(yǎng)液，PBS清洗1 次，加入20 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃溫育30 min后，再次用PBS清洗1 次，加入多聚賴氨酸固定30 min，PBS洗清3 次，進行封片觀察，并利用Image J軟件對相對熒光強度進行分析。檢測小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞內(nèi)ROS的清除作用。

1.3.9 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞凋亡的影響

將INS-1細胞進行種板，貼壁培養(yǎng)后用質(zhì)量濃度50 μg/mL小米抗氧化肽預(yù)處理1 h，再加入終濃度0.5 mmol/L的H2O2處理，同時設(shè)置對照組（不作任何處理）和H2O2組（僅加入0.5 mmol/L H2O2），培養(yǎng)24 h，參考Annexin-V/FITC凋亡檢測試劑盒說明書進行實驗，利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.3.10 qPCR分析相關(guān)抗氧化酶基因表達

細胞處理同1.3.7節(jié)方法。培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，利用TRIzol方法提取RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA合成。利用表1引物采用SYBR Green方法進行qPCR，反應(yīng)體系20 μL，數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt法。

表 1 qPCR引物設(shè)計Table 1 Primer design for qPCR

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小米抗氧化肽的分離純化

還原能力的強弱可以反映物質(zhì)的潛在抗氧化活性，是體外抗氧化活性的一個重要指標。抗氧化劑的還原力與其抗氧化活性之間存在一定的關(guān)系，還原力越強，抗氧化活性越強。因此，可通過還原力來表示其抗氧化活性的大小。

圖 1 Sephadex G-25純化小米抗氧化肽的層析及還原力結(jié)果Fig. 1 Elution prof i le and reducing power detection of peptides on Sephadex G-25 column

小米抗氧化肽粗提液經(jīng)過Sephadex G-25柱層析后，得到3 個洗脫峰，由圖1可知，其中第3個峰組分具有很強的抗氧化活性，而第1個峰組分和第2個峰組分有部分重疊，抗氧化活性很弱，在基線水平。

收集第3個峰組分濃縮后經(jīng)DEAE-32纖維素離子交換層析進一步分離純化，結(jié)果如圖2所示，第2個峰組分抗氧化活性最強，其余組分的抗氧化活性在基線水平。因此，收集第2個峰組分進行下一步實驗。

圖 2 DEAE-32純化小米抗氧化肽的層析及還原力結(jié)果Fig. 2 Elution prof i le and reducing power detection of peptides on DEAE-32 column

利用凝膠過濾和離子交換層析的方法分步進行多肽的純化是一種純化效率較高的方法，相比于單個類型的柱層析而言，能夠得到更高的純度。王雙玉等[19]通過Sephadex G-25柱層析和離子交換層析的方法從玉米酶解物中分離純化得到抗氧化肽。

2.2 小米抗氧化肽的純度鑒定

為鑒定經(jīng)Sephadex G-25柱層析和DEAE-32纖維素離子交換層析純化后的小米抗氧化肽的純度，以便為進一步的化學(xué)實驗和細胞實驗提供良好的實驗材料，采用醋酸纖維素薄膜電泳進行小米抗氧化肽純度的鑒定。

圖 3 小米抗氧化肽醋酸纖維素薄膜電泳圖Fig. 3 Cellulose acetate electrophoresis pattern of purif i ed peptides

由圖3可知，其醋酸纖維素薄膜電泳圖譜僅顯示單一條帶，說明小米抗氧化肽基本上得到了純化，達到電泳純。

2.3 小米抗氧化肽的自由基清除作用

超氧陰離子自由基不僅本身有毒性，其經(jīng)一系列反應(yīng)生成的羥自由基也會對生物體有所損害。因此，尋找對自由基，特別是超氧陰離子自由基和羥自由基具有較強清除作用的天然抗氧化劑或清除劑，已成為一個非常重要的研究領(lǐng)域[20]。DPPH自由基是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，通常作為檢驗自由基清除能力的標準物質(zhì)[21]。

圖 4 小米抗氧化肽對自由基清除率的影響Fig. 4 Free radical scavenging effect of antioxidant peptides

由圖4可知，經(jīng)Sephadex G-25和DEAE-32纖維素分離純化的小米抗氧化肽對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基的清除率隨著小米抗氧化肽質(zhì)量濃度升高而上升，當小米抗氧化肽質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，對這3 種自由基的清除率分別為（62.71±3.86）%、（73.56±4.51）%和（82.62±5.25）%，說明分離純化的小米抗氧化肽具有較高的清除自由基的能力。相比于實驗室前期制備的未純化小米抗氧化肽，其自由基清除能力更強[13]。

2.4 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞活力的影響

胰島細胞對ROS敏感，容易受到ROS的損傷，研究表明氧化應(yīng)激參與了糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[22]，利用天然抗氧化物質(zhì)進行胰島細胞保護從而保持其細胞活力是一種保護胰島細胞的有效方法[23]。

圖 5 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞存活率影響Fig. 5 Effect of antioxidant peptides on the viability of INS-1 cells subjected to oxidative stress induced by H2O2

由圖5可見，H2O2組I N S-1細胞存活率為（52.30±3.96）%，當加入不同質(zhì)量濃度的小米抗氧化肽后，隨著小米抗氧化肽質(zhì)量濃度的增加，INS-1細胞存活率上升，用50 μg/mL小米抗氧化肽處理時細胞的存活率達到（96.30±5.21）%。結(jié)果表明小米抗氧化肽對細胞存在保護作用。

2.5 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞內(nèi)ROS水平的影響

ROS是生物有氧代謝過程中的一種副產(chǎn)物，它化學(xué)反應(yīng)活性極強，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和保持機體穩(wěn)定性方面起著重要作用[24]。

當只用H2O2處理INS-1細胞時（圖6B），細胞內(nèi)ROS水平明顯高于對照組（圖6A），加入終質(zhì)量濃度50 μg/mL小米抗氧化肽保護時，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生明顯減少（圖6C），說明小米抗氧化肽能夠減少INS-1細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，緩解INS-1細胞氧化應(yīng)激。

圖 6 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞內(nèi)ROS的影響Fig. 6 Effect of antioxidant peptides on ROS activity in INS-1 cells

2.6 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞凋亡的影響

圖 7 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞凋亡率的影響Fig. 7 Effect of antioxidant peptides on cell apoptosis in INS-1 cells subjected to oxidative stress induced by H2O2

胰島細胞凋亡是其功能退化的主要機制之一，抑制胰島細胞凋亡可在一定程度上維持胰島功能[25]。王婧茹等[26]利用番石榴酸對INS-1細胞氧化應(yīng)激損傷及細胞凋亡的抑制作用進行了研究。

由圖7可知，對照組、H2O2組、小米抗氧化肽保護組細胞凋亡率分別為（2.61±0.13）%、（8.82±0.26）%、（2.76±0.39）%。H2O2組細胞凋亡率顯著高于對照組（P＜0.05）；50 μg/mL小米抗氧化肽+H2O2組INS-1細胞凋亡率顯著低于H2O2組（P＜0.05）。本實驗說明H2O2導(dǎo)致細胞發(fā)生凋亡，小米抗氧化肽對其具有保護作用。

2.7 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞內(nèi)抗氧化酶mRNA表達水平的影響

NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化元件（antioxidant response element，ARE）是細胞內(nèi)重要的抗氧化信號通路[27]。Nrf2與胞質(zhì)接頭蛋白（cytoplasmic linker protein，Keap1）結(jié)合定位于細胞質(zhì)，當受到調(diào)節(jié)后，Keap1釋放Nrf2入核，Nrf2入核后與抗氧化元件ARE結(jié)合，使NQO1、GST等II相抗氧化酶的表達升高[28-29]。有研究表明，H2O2能夠誘導(dǎo)抗氧化酶的表達，是細胞對ROS的應(yīng)激反應(yīng)[30]，而天然抗氧化物能夠通過誘導(dǎo)NQO1等的表達上調(diào)，起到抑制H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷的作用[31]。

圖 8 小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞mRNA表達的影響Fig. 8 Effect of antioxidant peptides on mRNA expression antioxidant enzymes in INS-1 cells subjected to oxidative stress induced by H2O2

如圖8所示，小米抗氧化肽能夠影響SOD1、CAT、GST、NQO1 mRNA表達水平，用H2O2處理INS-1細胞時，4 種抗氧化酶mRNA表達升高（P＜0.05）；添加小米抗氧化肽保護時，mRNA的表達水平顯著升高（P＜0.05），說明小米抗氧化肽能夠激活Nrf2信號通路，上調(diào)相關(guān)抗氧化酶的表達，這可能是小米抗氧化肽抑制細胞氧化應(yīng)激的作用機制。

3 結(jié) 論

本研究在前期酶解法制備獲得小米抗氧化肽的基礎(chǔ)上，并通過Sephadex G-25柱層析和DEAE-32纖維素離子交換層析的方法分離純化，通過DCFH-DA熒光實驗、MTT實驗和流式細胞技術(shù)證明小米抗氧化肽能夠抑制H2O2誘導(dǎo)損傷的INS-1細胞凋亡。同時，利用qPCR技術(shù)初步探索了小米抗氧化肽對細胞保護的作用機制。以上結(jié)果表明，小米抗氧化肽對H2O2誘導(dǎo)的細胞損傷具有較好的保護作用。本實驗采用INS-1細胞進行細胞水平的實驗，小米抗氧化肽是否在動物體內(nèi)具有相關(guān)活性和其作用機制還有待進一步研究。