鱈魚皮膠原蛋白肽在Caco-2細胞單層模型中的吸收機制

陳 銳，丁國芳,,*，楊最素，余方苗，黃芳芳，唐云平，張小軍，陳 思，梅光明

（1.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江省海洋生物醫用制品重點工程技術研究中心，浙江 舟山 316022；2.浙江省海洋水產研究所，浙江 舟山 316021）

目前，各種食物來源的活性肽已被報道具有抗腫瘤[1-2]、抗凝血和抗血栓[3-4]、抗病毒[5]、免疫調節[6]、抗高血壓[7]等作用。因此，食用含有生物活性肽的功能性食品成為人們預防疾病和對疾病的輔助性治療的一種新型策略。鱈魚（Melanogrammus aeglefinus）屬于鱈形目鱈魚科黑線鱈屬，是底層冷水性群聚魚類，我國鱈魚年加工量40萬～50萬 t，魚皮作為下腳料，占加工量的8%左右。近年來的研究發現，鱈魚皮中的活性肽在抗氧化、降血壓和抗胃潰瘍等方面表現出顯著的功效[8-10]。鱈魚皮中的蛋白主要為膠原蛋白，其含量最高可達到80%[11]，因膠原蛋白和膠原蛋白肽具有廣泛的生物活性，目前已被用作保健食品。本實驗室前期研究表明，鱈魚皮膠原蛋白肽（cod skin collagen peptide，CSCP）具有較好的抗氧化活性，能夠作用于經脂多糖誘導后損傷的正常肝Chang liver細胞，使細胞內抗氧化酶活力顯著升高、上清液中轉氨酶活力下降，降低細胞早期凋亡率，對肝細胞損傷具有一定的修復能力；其對四氯化碳誘導的小鼠慢性和急性肝損傷也具有一定的預防和保護作用[12-13]。CSCP在細胞和動物實驗中均表現出良好的生物活性，細胞實驗表明完整的CSCP對肝細胞具有修復作用。然而，在動物實驗中，CSCP經灌胃方式給藥的體內消化吸收過程較為復雜，其在胃腸道的轉運吸收機制尚不明確。因此，闡明CSCP在胃腸道的穩定性對于研究其在腸道中的吸收機制具有重要意義。Caco-2細胞單層模型是目前最成熟也是應用最多的體外吸收模型，廣泛用于研究口服藥物、肽類等營養物質在腸道的吸收機制[14-15]。為了有效地開發利用CSCP，本實驗擬對其在胃腸道中的穩定性進行評價，并使用Caco-2細胞模型研究CSCP的跨膜轉運特性，從細胞水平探究其在腸道的吸收機制，為深入研究CSCP的口服吸收機制及藥物代謝動力學提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Caco-2細胞株購于中國科學院細胞庫，由浙江省海洋生物醫用制品重點工程技術研究中心代培養。CSCP由浙江省海洋生物醫用制品重點工程技術研究中心自制，分子質量為7 700 Da，N端前20 個氨基酸序列為：GEMGPAGAKGAQGKTGPVGE。

鱈魚皮 大連鴻運海產品加工廠；MEM（minimum Eagle’s medium）粉末培養基、質量分數0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸 美國Gibco公司；胎牛血清 杭州四季青生物工程有限公司；CCK-8（cell counting kit-8）試劑盒日本同仁公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、三氟乙酸、維拉帕米、MK-571、氧化苯砷、去氧膽酸鈉 美國Sigma公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒 南京建成生物工程研究所；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Merck公司；Transwell培養板（聚碳酸酯膜直徑24 mm，孔徑0.4 μm，膜面積4.5 cm2） 美國Corning公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Forma3111型CO2培養箱 美國Thermo Scientif i c公司；多功能酶標儀 美國美谷分子儀器有限公司；倒置相差顯微鏡 日本OLYMPUS公司；Millicell ERS-2細胞電阻儀 美國Millipore公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent公司；透射電子顯微鏡 日本日立儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC法測定CSCP含量

色譜條件：Z O R B A X S B-C18分析型色譜柱（9.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長220 nm；流速2 mL/min；流動相A為超純水（含體積分數0.05%三氟乙酸溶液），流動相B為乙腈（含體積分數0.05%三氟乙酸溶液），采用等度洗脫方式，流動相A與流動相B的體積比為85∶15；柱溫25 ℃；自動進樣，進樣量20 μL。以CSCP的峰面積對鱈魚皮膠原蛋白標準溶液的質量濃度進行線性回歸得到回歸方程進行定量。

1.3.2 CSCP在胃腸道穩定性的測定

1.3.2.1 CSCP在接近胃腸道環境的不同pH值中的穩定性

按戎曉娟等[16]的方法稍作修改。取0.9 mL不同pH值（1.2、2.5、5.0、6.5、7.4～8.0）的磷酸鹽緩沖液，分別加入0.1 mL 10 mg/mL CSCP溶液，置于37 ℃水浴中，分別于0、10、30、60、120、180 min時取樣，100 ℃滅酶15 min，利用HPLC標準曲線測定CSCP質量濃度，CSCP最終質量濃度與初始質量濃度的比值即為剩余百分率。

1.3.2.2 CSCP在人工胃液和人工腸液中的穩定性

將CSCP加入人工胃液和人工腸液中，使其質量濃度為1 mg/mL，漩渦振蕩2 s，并于37 ℃孵育，分別于0、10、30、60、120、180 min時取樣，100 ℃滅酶15 min，利用HPLC標準曲線測定CSCP質量濃度，CSCP最終質量濃度與初始質量濃度的比值即為剩余百分率。

1.3.3 細胞培養

Caco-2細胞在MEM培養液（含質量分數20%胎牛血清、青霉素G 100 IU/mL、鏈霉素100 IU/mL）中進行培養，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中孵育，每天換液，待細胞長至80%以上時用質量分數0.25%胰蛋白酶溶液進行消化傳代。取對數生長期的細胞進行實驗。本實驗所用的Caco-2細胞為25～35 代。

1.3.4 CSCP細胞毒性實驗

使用CCK-8試劑盒檢測給予不同質量濃度CSCP后Caco-2細胞的存活率。將Caco-2細胞以1×104個/mL接種于96 孔培養板中，每孔加入細胞懸液100 μL。常規條件下培養24 h后吸去培養液。將Caco-2細胞隨機分為空白對照組（只加MEM培養液）和藥物組（CSCP質量濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00 mg/mL），空白孔不接種細胞，加入等量磷酸鹽緩沖液。在培養箱中孵育6 h后，吸去舊培養液，加入新鮮培養液100 μL，然后向每孔加10 μL CCK-8，在培養箱中繼續培養4 h，使用酶標儀測定450 nm波長處OD值。按式（1）計算細胞存活率。

式中：OD1為藥物組OD值；OD2為空白對照組OD值；OD3為空白孔OD值。

1.3.5 Caco-2細胞單層模型的建立與評價

1.3.5.1 Caco-2細胞單層模型的建立

取Caco-2細胞制成密度為1×105個/mL的單細胞懸液，先加入2 mL新鮮培養基于Transwell 6 孔板板底側（basolateral side，BL），再加入2 mL細胞懸液于6 孔板頂側（apical side，AP），接種后隔天換液，一周后每天換液。空白孔不接種細胞，加入等量磷酸鹽緩沖液。培養至21 d，將細胞單層連同聚碳酸酯膜一同取下，透射電子顯微鏡觀察細胞分化情況。

1.3.5.2 TEER的測定

用Millicell-ERS電阻儀測定各孔電阻值，細胞單層的跨膜電阻值（transepithelial electrical resistance，TEER）按照公式（2）計算。

式中：Rt為細胞孔電阻值/Ω；R0為空白孔電阻值/Ω；A為Transwell小室有效膜面積/cm2。

1.3.5.3 ALP活力的測定

ALP是Caco-2細胞刷狀緣的標志性酶，可以根據此酶的活力來分析腸上皮細胞的分化程度。使用ALP試劑盒分別測定Caco-2細胞內、6 孔板AP側和BL側的ALP活力。Caco-2細胞單層生長至7、14、21 d時，吸干小室內、外培養液，刮取細胞，用細胞裂解液破碎細胞使之釋放出ALP，按試劑盒方法測定細胞培養液及細胞內ALP活力。

1.3.6 CSCP的細胞轉運實驗

1.3.6.1 CSCP在Caco-2細胞單層的雙向轉運

取出已建立好的Caco-2細胞單層模型，吸干內、外側培養液，培養小室內、外側各加入2 mL 37 ℃的HBSS（Hank’s balanced salt solution），漂洗3 次，清除細胞表面干擾物質。內側加入2.5 mL HBSS，外側加入3.0 mL HBSS，在37 ℃培養箱中平衡30 min。按1.3.5.2節方法計算TEER值，選擇TEER大于400 Ω·cm2的細胞單層吸干HBSS繼續實驗。對于從AP向BL側的轉運，在AP側加入2.0 mL質量濃度為0.25 mg/mL的CSCP溶液（溶解于HBSS）作為供給池，BL側加入2.5 mL HBSS作為接收池。對于從BL向AL側的轉運，在BL側加入2.5 mL質量濃度為0.25 mg/mL的CSCP溶液（溶解于HBSS）作為供給池，AP側加入2.0 mL HBSS作為接收池。加樣后立即將Transwell板置于恒溫搖床中孵育（37 ℃、40 r/min），于0、30、60、90、120、150、180 min時分別在接收池取樣150 μL，利用HPLC測定CSCP質量濃度。從AP向BL側轉運實驗中，不同時間點BL側吸收的藥量（累積轉運量）以QrBi表示；從BL向AP側轉運實驗中，不同時間點AP側室吸收的藥量（累積轉運量）以QrAi表示，分別按式（3）、（4）計算[17]。

式中：0.15為取樣體積/mL；2.5和2.0分別為接收池BL側和AP側緩沖液的總體積/mL；ρri為接收池第i個時間點的實際質量濃度/（mg/mL）。

1.3.6.2 質量濃度對CSCP轉運的影響

細胞單層的前處理同1.3.6.1節方法，在AP側分別加入2.0 mL質量濃度為為0.02、0.04、0.08、0.10、0.25 mg/mL的CSCP溶液，隨后的轉運實驗同1.3.6.1節方法。180 min內累積轉運量的計算如公式（3）。

1.3.6.3 不同藥物對CSCP轉運的影響

為了探究CSCP在Caco-2細胞的轉運中的吸收途徑及是否受到某些轉運蛋白的介導，進行了進一步的研究。細胞單層的前處理同1.3.6.1節方法，隨后在AP側分別加入2.0 mL含有維拉帕米（100 μmol/L）、MK-571（50 μmol/L）、氧化苯砷（25 mmol/L）、去氧膽酸鈉（100 mmol/L）和不加藥物（空白對照組）的CSCP溶液（0.25 mg/mL），BL側加入2.5 mL HBSS，隨后的轉運實驗同1.3.6.1節方法。其中，維拉帕米和氧化苯砷溶解于含體積分數0.1% DMSO的HBSS中，MK-571和去氧膽酸鈉溶解于不含DMSO的HBSS中。180 min內累積轉運量的計算如公式（3）。CSCP透過Caco-2細胞單層的表觀滲透系數Papp按式（5）計算[18]。

式中：ΔQ為時間Δt/s內的累積轉運量/mg；A為聚碳酸脂膜的面積（4.5 cm2）；ρ0為CSCP初始質量濃度/（mg/mL）。

外排比率（efflux ratio，ER）用Papp（B-A）（從BL向AP側轉運）與Papp（A-B）（從AP向BL側轉運）的比值表示[19]。

1.4 數據分析

2 結果與分析

2.1 CSCP在不同pH值中的穩定性分析

圖 1 CSCP在不同pH值溶液中的穩定性結果Fig. 1 Stability of CSCP under different pH conditions

如圖1所示，經HPLC分析可得，CSCP在接近胃腸道環境的各pH值中基本保持穩定，在180 min內降解緩慢，180 min時仍有90%以上保持原型。

2.2 CSCP在人工胃液和人工腸液中的穩定性分析

圖 2 CSCP在人工胃液（A）和人工腸液（B）中的穩定性結果Fig. 2 Stability of CSCP in artif i cial gastric juice (A) and artif i cial intestinal juice (B)

如圖2所示，在前10 min內，CSCP在人工胃液（圖2A）和人工腸液（圖2B）內均降解了6%左右；10 min后CSCP在兩種溶液中均降解緩慢；180 min后，在人工胃液和人工腸液中最終分別剩余94.02%和94.46%。人工胃液和人工腸液對CSCP穩定性的影響并不大，可能是胃蛋白酶的水解位點為色氨酸、苯丙氨酸和蘇氨酸的氨基端，而Edman自動降解法測得CSCP的氨基端為甘氨酸；而且CSCP是由鱈魚皮膠原蛋白經胰蛋白酶酶解得到，所以腸液中的胰蛋白酶對CSCP幾乎沒有影響，該結果與接近腸道pH值時的穩定性基本一致。

2.3 不同質量濃度CSCP對Caco-2細胞存活率的影響

表 1 不同質量濃度CSCP對Caco-2細胞存活率的影響Table 1 Effect of CSCP at various concentrations on Caco-2 cell viability

CCK-8實驗數據（表1）表明，隨著CSCP質量濃度的增加，Caco-2細胞存活率逐漸降低。在CSCP質量濃度為0.10、0.25 mg/mL時，Caco-2細胞的存活率大于90%，在質量濃度為1.00 mg/mL時，細胞存活率降低，達到77.31%，與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）。而且，轉運實驗在3 h內完成，遠少于CCK-8實驗的6 h。因此，選取細胞存活率大于90%時CSCP的質量濃度進行后續的轉運實驗，0.25 mg/mL為最高轉運質量濃度。

2.4 Caco-2細胞單層模型的驗證結果

在6 孔板上培養21 d后，倒置顯微鏡下觀察到Caco-2細胞連接緊密，邊界清晰，形成了一層致密的細胞單層（圖3）。透射電子顯微鏡觀察聚碳酸酯膜上的Caco-2細胞單層（圖4），發現其微絨毛形成的刷狀緣整齊致密，細胞間形成緊密連接和橋粒，說明Caco-2細胞已出現極化，呈不對稱分布，具有小腸上皮細胞的某些結構特征。

圖 3 倒置顯微鏡下Caco-2細胞單層上皮表面觀察結果（×200）Fig. 3 Epithelium monolayer surface under an inverted microscope (× 200)

圖 4 透射電子顯微鏡下Caco-2細胞側面連接觀察結果（×40 000）Fig. 4 Caco-2 cell connection under an transmission electron microscope (× 40 000)

2.5 Caco-2細胞單層模型的評價結果

2.5.1 Caco-2細胞單層TEER值分析

本實驗中C a c o-2細胞單層T E E R值在（580.2±36.1）Ω·cm2之間變動。細胞TEER值超過400 Ω·cm2才能用于轉運實驗，得到可靠的結果[20]，表明本實驗條件下，Caco-2細胞成膜情況較好，致密性優良，可以用于CSCP的跨膜轉運實驗。

2.5.2 Caco-2生長過程中ALP活力的變化

表 2 Caco-2細胞單層ALP活力變化Table 2 Change in ALP activity of Caco-2 cell monolayer

由表2可見，細胞內ALP活力隨著時間的延長迅速增加，14 d以后增長趨勢稍緩，到第21天ALP活力比第7天增加了4 倍左右，說明Caco-2細胞逐漸分化成熟，AP側與BL側ALP活力比值的升高證明ALP的分布極不對稱，細胞出現了非常明顯的極化現象。

2.6 CSCP在Caco-2細胞單層的雙向轉運分析

圖 5 時間對CSCP跨Caco-2細胞單層轉運的影響Fig. 5 Time-course curves of CSCP transport across Caco-2 cell monolayer

如圖5所示，初始質量濃度一定時，轉運量隨時間的延長而增加，尤其是AP側到BL側的轉運在1 h后呈近似線性增加，且3 h內未見飽和；而BL側到AP側的轉運量在前2 h基本為0，2 h后緩慢增加。結果表明CSCP在Caco-2細胞單層的雙向轉運均存在明顯的時間依賴性，且在60～150 min時，AP側到BL側的轉運速率遠大于反向轉運速率，AP側到BL側3 h內轉運量也明顯高于BL側到AP側，提示CSCP的轉運具有方向性，且受到某種轉運蛋白的外排作用，從累積轉運量來看，Caco-2細胞單層對CSCP的吸收作用大于外排作用。

2.7 質量濃度對CSCP跨膜轉運的影響分析

圖 6 質量濃度對CSCP跨Caco-2細胞單層轉運的影響Fig. 6 Concentration-dependent CSCP transport across Caco-2 cell monolayer

由圖6可以發現，在轉運的3 h內，CSCP的累積轉運量隨質量濃度的升高而增加，說明CSCP的跨膜轉運是濃度依賴型，且在實驗的質量濃度范圍內沒有達到飽和，提示CSCP在Caco-2細胞單層的轉運以被動轉運為主。

2.8 藥物種類對CSCP跨膜轉運的影響

圖 7 藥物種類對CSCP轉運的影響Fig. 7 Effects of drugs on CSCP transport

多肽和蛋白質藥物的口服吸收途徑主要包括載體轉運、胞飲作用和細胞旁路途徑[21]。如圖7所示，與空白對照組相比，去氧膽酸鈉明顯增強了CSCP的跨膜轉運（P＜0.01），去氧膽酸鈉是旁路轉運促進劑，能打開細胞間的緊密連接[22]，表明CSCP的主要跨膜機制是細胞旁路途徑；MK-571為多藥耐藥蛋白抑制劑[23]，也增加了CSCP的轉運，且與空白對照組相比具有顯著性差異（P＜0.05）；維拉帕米（P-糖蛋白抑制）和氧化苯砷（內吞抑制劑）對CSCP的轉運沒有顯著影響，表明在CSCP的吸收過程中，內吞不是主要機制，多藥耐藥蛋白介導了CSCP的外排。不同轉運條件下的Papp見表3。

由表3可知，比較Papp發現，Papp（B-A）/Papp（A-B）值小于1，即ER值小于1，提示CSCP的轉運具有方向性，攝取作用大于外排作用。加入去氧膽酸鈉后，Papp增加為空白對照的4 倍左右，差異極顯著（P＜0.01）；加入MK-571后Papp也有所增加，約為空白對照組的1.4 倍，與空白對照組相比差異顯著（P＜0.05），其余藥物對Papp沒有顯著影響。

3 討 論

多年來人們一直認為蛋白質口服后，大多數在體內酶的作用下被完全水解為氨基酸再吸收入血[24]。近年來，一些以蛋白質為主的藥物口服后可經胃腸道吸收進入血液循環。研究發現，口服重組水蛭素-2可部分以其原型活性形式被吸收入血并產生抗凝作用，回腸是其最佳吸收部位[25-26]。張倩等[27]發現鹿茸中分子質量小于45 kDa的蛋白可以透過腸壁吸收，口服給予大鼠異硫氰酸熒光素標記的鹿茸蛋白，在血清中能檢測到熒光蛋白。關于胰島素的研究表明，胰島素在腸道引入后，被上皮細胞吸收并進入血液循環起到降低血糖作用，通過組織切片的免疫化學顯示，胰島素以內吞的形式被吸收[28]。大量研究表明一些具有生理活性的多肽和蛋白質可以被腸道上皮細胞吸收而進入血液循環，但生物利用度并不高。為了提高其生物利用度、開發蛋白質和多肽類藥物的口服制劑，一些新的劑型和給藥方法成為研究熱點，目前主要有結腸定位釋藥系統、脂質體載體和微乳載藥等[21]。

口服是最方便也是最容易讓人接受的給藥途徑，但有些藥物因在胃腸道不穩定、生物利用度低等原因而不能制成口服劑型。因此，在設計、優化、選擇口服藥物時，預測其腸道吸收是主要考慮因素之一。用于評估藥物吸收的一系列臨床前方法包括計算機、體內、體外、在體和離體等方法[29]。然而，當今社會和科學對動物的關愛以及制藥行業對快速、經濟和可靠模型的需求，使得人們極其迫切地尋求和建立與體內吸收具有良好相關性的模型。Caco-2細胞模型法最早由Hidalgo等[30]在1989年提出，一旦匯合成完整細胞單層，Caco-2細胞就會分化成在結構和功能上與成熟小腸細胞類似的細胞。在標準培養條件下，典型的微絨毛、一些分子的轉運系統、代謝酶和細胞間的緊密連接都能表達[31]。而且Caco-2細胞來源于人，同源性較好，實驗條件易受控制。基于以上特征，Caco-2細胞模型能從細胞水平評估藥物的黏膜滲透率，從而闡明藥物的腸吸收機制。

目前，膠原蛋白肽的保健功能主要在抗氧化、美容護膚、止血和免疫等方面[32]，還鮮有關于膠原蛋白肽對肝損傷保護作用的研究。現有的肝病治療主要依靠化學藥物，但化學藥物都具有一定的毒性。CSCP是本課題組從水產加工副產物鱈魚皮中提取獲得的膠原蛋白肽，其具有良好的護肝活性[12-13]，無毒且安全，是理想的輔助治療保健品。為有效地開發利用CSCP，本研究建立了Caco-2細胞單層模型并研究CSCP跨腸細胞的轉運特性，評估CSCP的黏膜滲透率，探究CSCP的跨膜吸收機制。在進行轉運實驗前，首先對CSCP的細胞毒性進行評價，選擇細胞存活率大于90%的質量濃度進行實驗。若轉運質量濃度對Caco-2細胞有毒性，則轉運過程中TEER值可能下降到低于標準值，細胞間緊密連接變松散，計算得到的轉運量和Papp會比實際值偏大。實驗表明CSCP跨Caco-2細胞轉運受到多種因素的影響，呈現明顯的濃度依賴性和時間依賴性，Papp也隨時間的延長逐漸增大。化合物的Papp與人體內的吸收率具有良好的相關性，Papp為1×10-6～10×10-6cm/s，表明體內吸收適中，相當于給藥劑量的20%～70%[33]。本實驗測得CSCP的Papp為（8.51±0.27）×10-6cm/s，說明CSCP吸收良好。由于Caco-2細胞單層的緊密連接比人和動物小腸的更緊密一些[31]，通過細胞旁路轉運的化合物在Caco-2細胞模型中的滲透率比體內吸收稍低。

4 結 論

CSCP在模擬胃腸道環境中較為穩定，其跨Caco-2細胞單層轉運的機制為細胞旁路途徑，其外排受到多藥耐藥蛋白的介導；CSCP的Papp為（8.51±0.27）×10-6cm/s，說明其在體內吸收適中。本研究從細胞水平探究了CSCP在腸道中的吸收機制，為深入研究CSCP的口服吸收機制及藥物代謝動力學提供依據。