硒化米胚多糖的抗氧化性

羅 敏，陳德經,2,*，韓 豪,2，辛 茜

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西 漢中 723001；2.陜西理工大學，陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723001）

水稻是我國主要糧食作物之一，大米胚芽（簡稱米胚）是稻米的胚胎，含胚量較高，在大米籽粒中占2.0%～2.5%，在我國其年產量約有10萬 t，也是谷物加工的副產物，在大米加工過程中大部分米胚芽脫落入副產品米糠中[1]。在國外，米胚被著稱為“天賜營養源”[2]，它具有極高的營養價值，營養成分比較全面且含量十分豐富，糖分質量分數27.13%、脂肪質量分數26.44%、蛋白質量分數22.25%、水分質量分數12.36%、粗纖維質量分數3.22%、灰分質量分數8.41%、鈣含量37.40 mg/100 g、鐵含量11.40 mg/100 g[3]。近年來研究發現，米胚多糖具有抗腫瘤、提高免疫力、降血糖、抗肥胖與心血管疾病、抗輻射等生理功能[4-8]，因此廣泛用于營養保健品、醫藥、功能食品等。

硒為Ⅵ族元素，是生物體所必需的礦物質，與人體健康密不可分。研究發現硒可降低癌癥、心血管病發病率，并具有抗衰老作用[9]。發生在中國的克山病和大骨節病與體內低水平硒有關，補充適量的硒可增強人體免疫力、提高視力、防治肝壞死、延緩衰老[10]。根據1980年美國國家科學院公布的礦物質營養素硒的推薦的允許攝入量50～200 μg/（人·d）[11]。多糖和硒可防治多種疾病，近年來對多糖和硒活性的研究較為深入，但將多糖與硒有機結合成為硒多糖，國內外的研究尚處于起步階段[12]。米胚多糖與硒結合生成有機化合物硒多糖，與大多數毒性較大的無機硒化合物相比更安全[13]，且具備了硒元素與多糖自身的天然價值，更能增強生物活性和生物體的吸收與利用。研究表明，硒多糖具有抗氧化、抗腫瘤、降血糖、提高免疫力等功效[14-18]。

利用人工合成的硒多糖有靈芝硒多糖、枸杞硒多糖、大蒜硒多糖、甘草硒多糖、香菇硒多糖、紅棗硒多糖[19-24]，但將米胚多糖硒化及其體內外抗氧化功能鮮見文獻報道。本實驗根據枸杞多糖和紅棗多糖的硒化方法[20,24]，在不同條件下對米胚多糖（rice embryo polysaccharide，REP）進行硒化并測定其抗氧化活性，從而為硒化米胚多糖（selenium-rice embryo polysaccharide，Se-REP）的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

3 月齡昆明種小鼠48 只，購自西安交通大學醫學院實驗動物中心，許可證號SCXK（陜）2016-003，雌雄性各半，分籠飼養。

米胚（秈米） 勉縣定軍米業發展有限責任公司；米胚多糖（糖質量分數76.42%）由本研究室提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 北京索萊寶科技有限公司；過氧化氫、體積分數95%乙醇溶液 天津市富宇精細化工有限公司；硫酸亞鐵、水楊酸 天津市北聯精細化學品開發有限公司；鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷 上海源葉生物科技有限公司；鹽酸 四川川化青上化工有限公司；鐵氰化鉀、磷酸二氫鈉 天津市盛奧化學試劑有限公司；磷酸氫二鈉 成都市科龍化學試劑廠；三氯化鐵 天津市福晨化學試劑廠；三氯乙酸 上海精析化工科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、總抗氧化能力（total-antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒南京建成生物工程研究所；考馬斯亮藍G250、牛血清白蛋白 上海藍季科技發展有限公司。

1.2 儀器與設備

DK-98-Ⅱ恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；JA5003電子天平 上海舜宇恒平科學儀器有限公司；UV-1750型紫外-可見分光光度儀 日本島津儀器公司；TGL-20M離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 方法

1.3.1 硒化米胚多糖的制備

Se-REP1制備：按前期研究優化實驗條件制備硒化米胚多糖[25]，稱取米胚多糖1 g于50 mL燒杯中，加入25 mL蒸餾水超聲使其完全溶解，邊攪拌邊加入1 mL冰醋酸，形成透明溶液。再加入溶于少量蒸餾水的0.5 g亞硒酸鈉，于50 ℃水浴加熱反應42 h。反應結束后濃縮至原體積的1/3，濃縮液裝入透析袋中，去離子水透析過夜，然后取少量透析液加入抗壞血酸檢測，直至無紅色出現時停止透析，離心除去沉淀，然后加入體積分數95%乙醇溶液，乙醇的最終體積分數為85%，冰箱冷藏，靜置12 h后，3 800 r/min離心10 min，沉淀用無水乙醇洗滌2 次，50 ℃真空干燥，得米胚硒多糖[26]。

Se-REP2制備：按前期研究優化實驗條件制備硒化米胚多糖，稱取1 g米胚多糖溶于50 mL體積分數0.5%硝酸溶液中，超聲攪拌使其完全溶解，再加入用少量蒸餾水溶解的0.7 g亞硒酸鈉，70 ℃下水浴加熱6 h，反應結束后濃縮至原體積的1/3，濃縮液裝入透析袋中，去離子水透析過夜，之后與Se-REP1步驟一致[27]。

Se-REP1、Se-REP2分別用硫酸蒽酮法[28]測定糖質量分數分別為46.13%、54.86%。原子熒光光度計[29]測定硒含量分別為（145.400±2.751）、（179.700±2.250）mg/kg。

1.3.2 體外抗氧化活性測定

1.3.2.1 ·OH清除率測定

采用Fenton體系[30]，向試管中加入不同質量濃度的樣品溶液2 mL，9 mmol/L硫酸亞鐵2 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL最后加入9 mmol/L雙氧水2 mL啟動反應，振蕩混勻，37 ℃水浴保溫30 min，冷卻至室溫后5 000 r/min離心10 min，取上清液在510 nm波長處每隔30 s測定其吸光度，以蒸餾水調零，平行測定吸光度3 次。按式（1）計算·OH的清除率。

式中：A0為不加樣品溶液，加入水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度；A1為加入樣品溶液和水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度；A2為加入樣品溶液但不加水楊酸-乙醇顯色劑的溶液吸光度。

1.3.2.2 DPPH自由基清除率測定

參考魏明等[31]的方法，取3 mL不同質量濃度的樣品溶液于試管中，分別加入3 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液（用體積分數95%乙醇溶液配制），振蕩混合后，避光26 ℃下放置30 min，然后在517 nm波長處檢測吸光度，用蒸餾水調零，平行測定吸光度3 次。按式（2）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為3 mL蒸餾水+3 mL DPPH溶液的吸光度；A1為3 mL樣品溶液+3 mL DPPH溶液的吸光度；A2為3 mL樣品溶液+3 mL 95%乙醇溶液的吸光度。

1.3.2.3 O2-·清除率測定

參考黃玲玲等[30]的方法并稍作修改，取不同質量濃度的樣品溶液1 mL，加入0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.2）4.5 mL，在25 ℃水浴10 min后，加入3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.2 mL混勻，在25 ℃水浴5 min，最后加入8 mmol/L HCl溶液終止反應，在299 nm波長處測定其吸光度，以蒸餾水調零，平行測定吸光度3 次。按式（3）計算O2-·清除率。

式中：A0為不加樣品溶液，加入鄰苯三酚的溶液吸光度；A1為加入樣品溶液和鄰苯三酚的溶液吸光度；A2為加入樣品溶液但不加鄰苯三酚的溶液吸光度。

1.3.2.4 還原力測定

參考徐春蘭等[9]的方法，取不同質量濃度的樣品溶液1 mL，加入0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）2 mL和質量分數1%的鐵氰化鉀溶液2 mL，混勻，在50 ℃水浴20 min后，加入10%三氯乙酸溶液2 mL，混勻后5 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL加入2 mL蒸餾水和0.5 mL質量分數0.1%三氯化鐵溶液，反應10 min后，在700 nm波長處測定其吸光度，平行測定吸光度3 次，以蒸餾水調零。吸光度越大表示其還原力越強。

1.3.3 體內抗氧化活性測定

1.3.3.1 動物分組與給藥

實驗小鼠48 只，喂養基礎飼料適應7 d后隨機分為8 組，每組6 只，分為空白對照組（每天灌胃同樣體積的0.9%生理鹽水）、VC組（陽性對照，灌胃10 mg/kg VC）、REPH組（灌胃480 μg/（kg·d） REP）、REPL組（灌胃160 μg/（kg·d） REP）、Se-REP1H組（灌胃480 μg/（kg·d） Se-REP1）、Se-REP1L組（灌胃160 μg/（kg·d） Se-REP1）、Se-REP2H組（灌胃480 μg/（kg·d） Se-REP2）、Se-REP2L組（灌胃160 μg/（kg·d）Se-REP2），硒元素的使用量是按照人體推薦量及小鼠與人之間的劑量換算得出，連續灌胃30 d，第30天禁食過夜，稱質量后，乙醚麻醉，心臟取血于1.5 mL離心管中，置于37 ℃水浴中放置30 min，然后轉移到4 ℃過夜，次日于4 ℃、4 000 r/min離心10 min得到血清，迅速分離小鼠的肝臟、腎臟、心臟用預先準備好的冷生理鹽水漂洗掉浮血，拭干，稱質量后，按料液比1∶9加入生理鹽水，制備成10%的組織勻漿液，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，收集上清液于-20 ℃保存，按照試劑盒說明分別測定血清及各組織中的SOD、GSH-Px活力、T-AOC、MDA含量[32-33]。

1.3.3.2 考馬斯亮藍法測定蛋白質量濃度

考馬斯亮藍G-250顯色液的制備：準確稱取0.100 g考馬斯亮藍G-250，加入50 mL體積分數95%乙醇溶液，此時溶液為藍色，再加入100 mL 體積分數85%磷酸溶液，此時溶液變為血紅色，最后加入蒸餾水在室溫條件下定容至1 L，溶液顏色最終變為褐色，過濾，避光保存[34]。

蛋白質標準曲線的建立：準確稱取0.100 g牛血清白蛋白，用生理鹽水溶解并定容到100 mL容量瓶，此標準溶液質量濃度為1 mg/mL。將標準溶液（1 mg/mL）用生理鹽水稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的蛋白標準液。分別取不同質量濃度的蛋白標準液1 mL于試管中，以蒸餾水作空白，分別加入5 mL考馬斯亮藍G-250溶液，搖勻，靜置2 min，在595 nm波長處測定吸光度[34]。以吸光度（y）為縱坐標，蛋白質量濃度（x/（mg/mL））為橫坐標，繪制標準曲線圖，其標準曲線方程為：y＝0.203 5x+0.154 2，R2＝0.995 5。

樣品的測定：準確移取樣品溶液400 μL，加入600 μL生理鹽水，按1.3.3.2節方法顯色，測其吸光度，并計算樣品蛋白質量濃度。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 體外抗氧化活性

2.1.1 ·OH清除能力

圖 1 REP、Se-REP1、Se-REP2對·OH的清除能力Fig. 1 Hydroxyl free radical scavenging capacity of REP, Se-REP1 and Se-REP2

從圖1可知，REP、Se-REP1、Se-REP2在實驗設置的質量濃度范圍內對·OH的清除作用隨質量濃度的增大而增強，且Se-REP1、Se-REP2的清除能力均比REP高。但清除作用顯然均沒有VC高。在質量濃度為0.5～1.5 mg/mL時，隨質量濃度的增加REP、Se-REP1、Se-REP2對·OH的清除率顯著升高，但當質量濃度在2.0 mg/mL以上時，隨質量濃度的增加，清除率緩慢增加。質量濃度在2.5 mg/mL時，REP、Se-REP1、Se-REP2對·OH的清除率分別為64.12%、73.92%、79.75%，其半抑制濃度（50% inhibitory concentration，IC50）分別為1.49、1.02、0.71 mg/mL，而VC在質量濃度1 mg/mL時清除率達到95%以上。可見Se-REP2的抗氧化性優于Se-REP1、REP，可為以后制備硒化多糖在功效等方面提供理論依據。

2.1.2 DPPH由基清除能力

圖 2 REP、Se-REP1、Se-REP2 對DPPH自由基的清除能力Fig. 2 DPPH free radical scavenging capacity of REP, Se-REP1 and Se-REP2

從圖2可以看出，REP、Se-REP1、Se-REP2 對DPPH自由基均有一定的清除作用，在實驗設置的質量濃度0.5～2.5 mg/mL范圍內，清除能力與質量濃度成正比，且Se-REP1、Se-REP2的清除能力均強于REP，但清除作用明顯均小于VC。當質量濃度在2.5 mg/mL時，REP、Se-REP1、Se-REP2對DPPH自由基的清除率分別43.03%、50.23%、59.49%，其Se-REP1、Se-REP2的IC50分別為2.25、1.88 mg/mL，而VC在質量濃度1.5 mg/mL時清除率達到95%以上，可見Se-REP2的抗氧化性優于Se-REP1、REP，可為以后制備硒化多糖在功效等方面提供理論依據。

圖 3 REP、Se-REP1、Se-REP2對·的清除能力Fig. 3 Superoxide anion radical scavenging capacity of REP, Se-REP1 and Se-REP2

從圖3可以看出，在實驗設置的質量濃度范圍內REP、Se-REP1、Se-REP2對·清除能力均有一定的清除作用，其清除能力與質量濃度成正比，且Se-REP1、Se-REP2的清除能力均強于REP。當質量濃度在2.5 mg/mL時，REP、Se-REP1、Se-REP2對·的清除率分別為47.84%、55.84%、64.78%，其Se-REP1、Se-REP2的IC50分別為2.03、1.73 mg/mL，而VC在質量濃度2 mg/mL時清除率達到94%以上，此外REP、Se-REP1、Se-REP2的清除率與VC的·清除能力差異較大，可見Se-REP2的抗氧化性優于Se-REP1、REP，可為以后制備硒化多糖在功效等方面提供理論依據。

2.1.4 還原力

圖 4 REP、Se-REP1、Se-REP2的還原力Fig. 4 Reducing power of REP, Se-REP1 and Se-REP2

從圖4可知，REP、Se-REP1、Se-REP2都具有一定的還原力，且隨著質量濃度的增加，其還原力增強，選用抗氧化劑較好的VC，在起始相同質量濃度范圍內的還原力做對比，發現REP、Se-REP1、Se-REP2均比VC的還原力弱。

2.2 體內抗氧化活性

2.2.1 不同劑量REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠體質量的影響

小鼠的體質量在某種程度上顯示了小鼠的生長情況，由表1知，隨著給藥時間的延長，每組小鼠的體質量也隨之逐漸增加。將REP、Se-REP1、Se-REP2、VC與空白對照組相比較，不存在顯著差異（P＞0.05），表明小鼠的體質量不受REP、Se-REP1、Se-REP2影響，即對小鼠生長發育沒有影響。

表 1 不同劑量REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠體質量的影響（n＝6）Table 1 Effects of REP, Se-REP1 and Se-REP2 at different doses on body mass in mice (n= 6)

2.2.2 不同劑量REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠血清中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響

表 2 REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠血清中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響（n＝6）Table 2 SOD, GSH-Px activity and T-AOC and MDA contents in serum of mice treated with REP, Se-REP1 and Se-REP2 (n= 6)

由表2可知，REPH、SeREP1L、SeREP1H、SeREP2L、SeREP2H對于小鼠血清中MDA含量均產生極顯著的降低效果（P＜0.01），對小鼠血清中SOD活力而言，也均高于空白對照組（P＜0.01），表現出較好的抗氧化活性。對于小鼠血清中GSH-Px活力而言，REP、SeREP1、SeREP2的效果均極顯著強于空白對照組（P＜0.01）。對于T-AOC的影響，REPH、SeREP1H、SeREP2H表現出極顯著的升高（P＜0.01），效果優于空白對照組。SeREP1、SeREP2在小鼠血清中的抗氧化能力強于REP，SeREP2比SeREP1的抗氧化能力強。

2.2.3 不同劑量REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠心臟中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響

由表3可知，不同的組別對于小鼠心臟中的T-AOC沒有顯著的提高作用。REPH、SeREP1L、SeREP1H、SeREP2L、SeREP2H對于小鼠心臟中SOD、GSH-Px活力的提高作用均極顯著強于空白對照組（P＜0.01），VC組與REPL組無顯著差異，效果接近，SeREP2H和SeREP1H效果極顯著高于其余組別（P＜0.01）。REPH、SeREP1H、SeREP2L、SeREP2H對小鼠心臟中的MDA含量與空白對照組相比具有極顯著的降低作用（P＜0.01），VC組與其余各組效果相差不大，SeREP2的MDA含量顯著低于SeREP1、REP。在小鼠心臟中SeREP1、SeREP2的抗氧化能力強于REP，SeREP2比SeREP1的抗氧化能力強。

表 3 REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠心臟中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響（n＝6）Table 3 SOD, GSH-Px activity and T-AOC and MDA contents in heart tissues of mice treated with REP, Se-REP1 and Se-REP2 (n= 6)

2.2.4 REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響

表 4 REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響（n＝6）Table 4 SOD, GSH-Px activity and T-AOC and MDA contents in liver of mice treated with REP, Se-REP1 and Se-REP2 (n= 6)

由表4可知，不同的組別對于小鼠肝臟中的MDA含量沒有顯著的降低作用。VC、REPH、SeREP1L、SeREP1H、SeREP2L、SeREP2H組小鼠肝臟中SOD活力均極顯著高于空白對照組（P＜0.01），表現出較好的抗氧化活性。對于小鼠肝臟中GSH-Px活力而言，REP、SeREP1、SeREP2的提高效果均極顯著強于空白對照組（P＜0.01）。對于T-AOC的影響，REPH、SeREP1H、SeREP2H表現出極顯著升高（P＜0.01），效果優于空白對照組，且SeREP1、SeREP2在小鼠肝臟中的抗氧化性比REP高。在小鼠肝臟中SeREP1、SeREP2的抗氧化能力強于REP，SeREP2比SeREP1的抗氧化能力強。

2.2.5 REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠腎臟中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的變化影響

表 5 REP、Se-REP1、Se-REP2對小鼠腎臟中SOD、GSH-Px活力、T-AOC及MDA含量的影響（n＝6）Table 5 SOD, GSH-Px activity and T-AOC and MDA contents in kidney of mice treated with REP, Se-REP1 and Se-REP2 (n= 6)

由表5可知，不同的組別對于小鼠腎臟中的MDA含量沒有顯著降低作用。SeREP2H對小鼠腎臟中SOD活力的提高作用極顯著強于其余各組（P＜0.01），其抗氧化性強于VC、SeREP1和REP。REPH、SeREP1L、SeREP1H、SeREP2L、SeREP2H組小鼠腎臟中GSH-Px活力均極顯著強于空白對照組（P＜0.01），VC與REPL效果相當。對于T-AOC的影響，SeREP1H、SeREP2H與其余組別相比表現出極顯著的提高作用（P＜0.01）。在小鼠腎臟中SeREP1、SeREP2的抗氧化能力強于REP，SeREP2比SeREP1的抗氧化能力強。

3 結 論

對兩種方法制備硒化的米胚多糖進行了體外抗氧化活性的研究，結果表明在設置的質量濃度范圍內，硒化后的多糖對·OH、DPPH自由基、O2-·都具有良好的清除效果，且隨著質量濃度的增加，清除率不斷升高，且清除能力均優于多糖，其還原力也逐漸增強并優于多糖。此外兩種制備方法中硝酸法制備的硒化米胚多糖的抗氧化能力比醋酸法制備的硒化米胚多糖更強。

體內抗氧化實驗結果表明SeREP1、SeREP2與REP在一定程度上都可提高小鼠血清及組織中的SOD、GSH-Px活力及T-AOC，且作用效果均強于REP，但在心臟中T-AOC不顯著，其中GSH-Px活力最顯著，這與姚昭等[32]實驗結果相似。Se-REP灌胃組的MDA含量在肝臟及腎臟中極雖低于空白對照組，但差異不顯著，只在血清和心臟中極顯著低于空白對照組（P＜0.01）。SeREP2和SeREP1均比REP的抗氧化性強，且硝酸法制備的SeREP2活性較強于醋酸法制備的SeREP1，綜合表明，硒化米胚多糖比米胚多糖的抗氧化活性強，可能是因為有機硒元素是許多酶的活性中心，其次SeREP2比SeREP1的抗氧化活性強，這可能是SeREP2中硒含量高于SeREP1而顯示出的差異。可見，不同的方法制備的大米胚芽硒多糖的抗氧化能力也不同，研究結果可為開發出具有更高抗氧化活性的米胚硒化多糖提供理論依據。