用生存分析模型挖掘LY6E基因表達(dá)與胃癌放療敏感性關(guān)系研究

簡(jiǎn)國(guó)浩，孫海橦，楊婧怡，敖 磊，湯在祥

(蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計(jì)學(xué)系，江蘇 蘇州 215000)

胃癌是一種常見(jiàn)的癌癥，胃癌的死亡率居全球癌癥患者死亡率中的第三位 ，僅次于肺癌和肝癌[1]。超過(guò)70%的胃癌新發(fā)病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，約50%的病例發(fā)生在亞洲東部，主要集中在中國(guó)[2]，中國(guó)胃癌發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)分別占全球胃癌發(fā)病和死亡的42.6%和45.0%[2]。可見(jiàn)胃癌的治療是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。目前癌癥的治療方法主要為手術(shù)和化療，胃癌的轉(zhuǎn)移是加重病情關(guān)鍵原因，而腫瘤的轉(zhuǎn)移是影響患者預(yù)后的重要因素。Lymphocyte antigen 6 complex,locus E(LY6E)與腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)[8]。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LY6E與乳腺癌的發(fā)展、免疫逃逸、耐藥性相關(guān)[3]，LY6E負(fù)調(diào)控乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移[4]；在胃癌上，研究發(fā)現(xiàn)LY6E的高表達(dá)是胃癌細(xì)胞存活、增殖和轉(zhuǎn)移的潛在重要因素[5]；在胰腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，LY6E在胰腺癌細(xì)胞系球中過(guò)度表達(dá)[6]。

然而，如今對(duì)LY6E的研究中，還沒(méi)有報(bào)道過(guò)LY6E的表達(dá)與胃癌放療敏感性的關(guān)系。本次研究中，假設(shè)LY6E低表達(dá)的患者具有放療敏感性，會(huì)從放療中獲得生存收益。本次研究以開(kāi)放的TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的腫瘤數(shù)據(jù)作為基礎(chǔ)，來(lái)研究放療敏感性和LY6E表達(dá)的聯(lián)系，以此來(lái)驗(yàn)證本研究的假設(shè)。

1 資料與方法

1.1一般資料：本研究的數(shù)據(jù)來(lái)源是TCGA (TCGA，http://cancergenome.nih.gov/)中胃癌患者LY6E的mRNAseq數(shù)據(jù)，患者均為美國(guó)人群，數(shù)據(jù)清理過(guò)程如下：首先，合并臨床數(shù)據(jù)信息，獲得患者的生存信息，將無(wú)生存結(jié)局或生存時(shí)間的患者去除。獲得有效的生存數(shù)據(jù)后，再與其他臨床指標(biāo)數(shù)據(jù)合并，獲得完整的臨床數(shù)據(jù)。其次，將下載到的LY6E的mRNAseq數(shù)據(jù)中的重復(fù)個(gè)體刪除，然后與清理過(guò)的臨床數(shù)據(jù)合并，獲得最終用于分析的數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)包括了371個(gè)患者。

1.2分析方法：在患者接受放療后，與不接受放療的患者相比，其生存率提高，獲得顯著的生存收益，即定義為具有放療敏感性；能夠預(yù)測(cè)個(gè)體放療敏感性或與個(gè)體放療敏感性有關(guān)的基因，稱為預(yù)測(cè)放療敏感性的生物標(biāo)記物。為驗(yàn)證本研究的結(jié)果，在分析時(shí)，本研究將數(shù)據(jù)隨機(jī)分為兩份，一份為測(cè)試數(shù)據(jù)，一份為驗(yàn)證數(shù)據(jù)。在兩份數(shù)據(jù)中采用同樣的分析方法，如果兩份數(shù)據(jù)的結(jié)果均與本研究假設(shè)一致，則驗(yàn)證本研究假設(shè)，說(shuō)明LY6E的表達(dá)與放療敏感性有關(guān)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：由于LY6E基因mRNAseq表達(dá)值在測(cè)試數(shù)據(jù)中呈現(xiàn)偏態(tài)分布，此時(shí)中位數(shù)更能體現(xiàn)樣本均數(shù)，所以本研究定義測(cè)試數(shù)據(jù)的中位數(shù)為高低表達(dá)的臨界值。接著對(duì)LY6E高低表達(dá)的患者分別進(jìn)行單因素和多因素的分析，分析放療和非放療組的生存差異。本研究采用R軟件survival包的生存分析模型進(jìn)行分析，生存曲線作圖采用rms包，以P值為0.05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1LY6E的表達(dá)水平以及臨床數(shù)據(jù)與患者生存的相關(guān)性分析：在本研究中，生存為最重要的觀察指標(biāo)，首先分析臨床指標(biāo)及LY6E表達(dá)水平與總生存的關(guān)系。由表1的分析結(jié)果可以看出，放療與生存有明顯的關(guān)聯(lián)，測(cè)試數(shù)據(jù)的單因素分析以及對(duì)照數(shù)據(jù)的單因素和多因素分析均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其他因素包括LY6E表達(dá)水平大多無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在測(cè)試數(shù)據(jù)和驗(yàn)證數(shù)據(jù)中，多因素分析的P值分別為0.38和0.23，表明患者生存與LY6E的表達(dá)水平無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。但年齡的驗(yàn)證數(shù)據(jù)和N分期的測(cè)試數(shù)據(jù)分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明這兩種因素可能與患者的生存有關(guān)。雖然放療與患者的總生存有明顯的關(guān)聯(lián)，但是這并不能證明放療能讓所有患者都收益，如果想要進(jìn)行精準(zhǔn)放療，就需要通過(guò)某種因素來(lái)辨別出患者放療后是否能得到較好的生存收益。

表1臨床指標(biāo)及LY6E表達(dá)水平與總生存的關(guān)系

臨床指標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)(n=185) 單因素分析 HR P值 多因素分析 HR P值 驗(yàn)證數(shù)據(jù)(n=186) 單因素分析 HR P值 多因素分析 HR P值 放療是0.51(0.27～0.97)0.040.47(0.22～1.04)0.060.32(0.16～0.64)0.001 090.36(0.17～0.77)0.008 85否111性別男1.50(0.89～2.52)0.131.37(0.80～2.34)0.251.05(0.66～1.66)0.851.22(0.75～1.98)0.42女111年齡>60歲1.12(0.68～1.83)0.661.01(0.60～1.72)0.961.82(1.08～3.07)0.022.51(1.36～4.66)0.003 37≤60歲111病例MT+DRT+SRT0.86(0.41～1.79)0.681.07(0.49～2.33)0.860.91(0.48～1.72)0.781.31(0.66～2.60)0.44類(lèi)型PT+TT111T 分期T3+T42.32(1.22～4.40)0.011.52(0.73～3.16)0.271.52(0.87～2.64)0.141.28(0.66～2.46)0.46T1+T2111N 分期N1+N2+N32.80(1.53～5.12)0.000 8452.36(1.12～5.01)0.021.37(0.79～2.38)0.271.40(0.59～3.29)0.44N01111M 分期M11.46(0.63～3.38)0.371.61(0.66～3.93)0.301.86(1.00～3.45)0.051.67(0.81～3.48)0.16M01111病理分期Ⅲ+Ⅳ2.17(1.32～3.56)0.002 21.38(0.69～2.75)0.361.64(1.00～2.69)0.051.53(0.69～3.38)0.29Ⅰ+Ⅱ1111靶向治療是0.80(0.50～1.26)0.331.26(0.43～3.67)0.680.57(0.36～0.91)0.020.93(0.25～3.49)0.91否1111化療是0.84(0.53～1.32)0.440.67(0.24～1.82)0.430.58(0.37～0.92)0.020.66(0.18～2.42)0.53否1111LY6E高表達(dá)1.58(1.00～2.50)0.051.23(0.77～1.98)0.380.95(0.60～1.50)0.820.74(0.46～1.21)0.23低表達(dá)1111

2.2臨床指標(biāo)與LY6E表達(dá)水平的關(guān)系：本研究采用卡方檢驗(yàn)單因素分析，分析LY6E的表達(dá)水平是否與臨床指標(biāo)有關(guān)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，LY6E的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。說(shuō)明如果LY6E的表達(dá)水平能夠提示患者是否具有放療敏感性，那么它有很大概率是一個(gè)獨(dú)立在臨床指標(biāo)外的分子標(biāo)記物。

表2LY6E表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系(例)

臨床指標(biāo)測(cè)試數(shù)據(jù)(n=185)LY6E高表達(dá)LY6E低表達(dá)P值驗(yàn)證數(shù)據(jù)(n=186)LY6E高表達(dá)LY6E低表達(dá) P值性別男62650.8458560.16女30284527年齡>6066590.2771520.45≤6026343231病例類(lèi)型MT+DRT+SRT21280.4926210.73PT+TT19152919NOS52504843T 分期T3+T472640.2777590.69T1+T220292624N 分期N1+N2+N367580.1973610.84N025353022M 分期M1750.751280.84M085889175病理分期Ⅲ+Ⅳ48370.1159460.83Ⅰ+Ⅱ39514437

2.3LY6E的高低表達(dá)組放療與患者生存的關(guān)系：本研究假設(shè)了LY6E低表達(dá)的患者具有放療敏感性，則需要探究LY6E低表達(dá)的患者在接受放療后生存率是否提高了。表3的分析結(jié)果表明，LY6E高表達(dá)組放療后并無(wú)明顯的生存收益，無(wú)論測(cè)試數(shù)據(jù)還是驗(yàn)證數(shù)據(jù)，調(diào)整前和調(diào)整后均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。但在低表達(dá)組的測(cè)試數(shù)據(jù)中，HR值為0.18(0.04～0.76)，P=0.02，多因素調(diào)整后的HR值為0.06(0.01～0.36)，P=0.002 36，即表明低表達(dá)組的患者在接受放療后，生存率有了顯著的提升，而驗(yàn)證數(shù)據(jù)的分析結(jié)果也能得出該結(jié)論，驗(yàn)證數(shù)據(jù)多因素調(diào)整后HR值為0.05(0.005～0.46)，P=0.008 39。通過(guò)表3的分析結(jié)果可見(jiàn)，LY6E低表達(dá)的患者接受放療后，生存率明顯提升，有顯著的生存收益。

圖1為測(cè)試數(shù)據(jù)和驗(yàn)證數(shù)據(jù)LY6E高低表達(dá)組通過(guò)是否放療為區(qū)別生成的生存曲線圖。圖1中高表達(dá)組(見(jiàn)圖1①、③)顯示，LY6E高表達(dá)的患者接受放療后沒(méi)有得到顯著的生存收益。而在低表達(dá)組(見(jiàn)圖1②、④)中，可見(jiàn)患者接受放療后獲得了明顯的生存收益。該結(jié)果與本研究的假設(shè)一致，即LY6E低表達(dá)的患者具有放療敏感性。本研究繼續(xù)對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出表3的全部數(shù)據(jù)分析結(jié)果。結(jié)果顯示，高表達(dá)組放療調(diào)整后的HR值為0.83(0.44～1.55)，P=0.55，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；反觀低表達(dá)組放療調(diào)整后的HR值為0.09(0.03～0.30)，P=0.000 096 2，也可得出低表達(dá)患者很可能擁有放療敏感性的結(jié)論。該進(jìn)一步對(duì)全部數(shù)據(jù)的研究也是為了防止因?yàn)闃颖玖窟^(guò)小而導(dǎo)致得出錯(cuò)誤的結(jié)論。

圖2中①是全體高表達(dá)患者分為放療與不放療兩組得到的生存曲線圖，顯示放療與不放療對(duì)LY6E高表達(dá)患者的生存率沒(méi)有明顯的影響。圖2中②是全體低表達(dá)患者分為放療與不放療兩組后得到的生存曲線圖，可見(jiàn)LY6E低表達(dá)的患者接受放療后生存率有了明顯的提升。圖2中③為接受放療的全體患者分為L(zhǎng)Y6E高低表達(dá)兩組而得到的生存曲線圖，也可見(jiàn)低表達(dá)的患者接受放療后得到了明顯的生存收益。圖2進(jìn)一步地說(shuō)明了LY6E低表達(dá)的患者具有較好的放療敏感性。

表3LY6E高低表達(dá)組放療與總生存關(guān)系分析

項(xiàng)目組別調(diào)整前(RT vs NRT) HR P值 調(diào)整后(RT vs NRT) HR P值 測(cè)試數(shù)據(jù)高表達(dá)組(n=92)0.84(0.40～1.74)0.631.28(0.47～3.47)0.63低表達(dá)組(n=93)0.18(0.04～0.76)0.020.06(0.01～0.36)0.002 36驗(yàn)證數(shù)據(jù)高表達(dá)組(n=103)0.64(0.30～1.40)0.280.72(0.29～1.76)0.47低表達(dá)組(n=83)0.04(0.005～0.29)0.001 770.05(0.005～0.46)0.008 39全部數(shù)據(jù)高表達(dá)組(n=195)0.73(0.43～1.24)0.240.83(0.44～1.55)0.55低表達(dá)組(n=176)0.12(0.04～0.34)0.000 066 20.09(0.03～0.30)0.000 096 2

注：調(diào)整因素為性別、年齡、病例類(lèi)型、TNM分期、病理分期及是否靶向治療

圖1 測(cè)試數(shù)據(jù)和驗(yàn)證數(shù)據(jù)LY6E表達(dá)水平與放療后生存關(guān)系

圖2 全部患者LY6E表達(dá)水平與放療后患者生存關(guān)系

3 討論

本研究使用了TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)公開(kāi)數(shù)據(jù)，沒(méi)有外部獨(dú)立的數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證，所以采用了交叉驗(yàn)證的方法，把數(shù)據(jù)隨機(jī)地分為兩組，再分別分析。研究中發(fā)現(xiàn)LY6E低表達(dá)的患者擁有較高的放療敏感性，但是LY6E高表達(dá)的患者對(duì)于放療并不敏感。這對(duì)于臨床放療是有一定的指導(dǎo)意義的。

雖然在過(guò)去的研究中，放療并不是治療胃癌最主要的手段，但是認(rèn)為放療能提高患者的生存率[7]，然而這并不說(shuō)明放療對(duì)所有患者都是有益的。本研究的結(jié)果也說(shuō)明了放療和患者的生存是有明顯的聯(lián)系的，但是放療的不良反應(yīng)仍然讓人們感到擔(dān)心。臨床工作中發(fā)現(xiàn)，患者放療后腫瘤消退程度有明顯差異，其主要原因就在于個(gè)體之間的放療敏感性有較大的差距。因此把胃癌患者中有顯著放療敏感性的患者劃分出來(lái)，進(jìn)行精準(zhǔn)放療，而剩余沒(méi)有放療敏感性的患者不接受放療，這樣使放療更加有效，也使得對(duì)放療不敏感的患者免去了放療帶來(lái)的不良反應(yīng)。由此可見(jiàn)，在臨床治療中，找到合適的生物標(biāo)志物，再以此來(lái)分辨出敏感人群具有重要意義。然而，到目前為止，在胃癌上尚未發(fā)現(xiàn)鑒別放療敏感性的有效分子標(biāo)記物。

Yeom CJ等人揭示了LY6E在惡性腫瘤生長(zhǎng)中的機(jī)制和功能聯(lián)系[8]。LY6E蛋白在多種腫瘤中高表達(dá)[9-10]。這些研究提示，LY6E與癌癥有明顯關(guān)聯(lián)。

本研究設(shè)計(jì)了這個(gè)實(shí)驗(yàn)，試圖去找出合適的生物標(biāo)志物。目前尚未見(jiàn)到有報(bào)道研究LY6E與胃癌放療敏感性的關(guān)系，研究的結(jié)果表明，LY6E有很大可能是提示胃癌放療敏感性的有效分子標(biāo)記物。本研究存在著一些不足之處，如樣本量較小，樣本都為T(mén)CGA數(shù)據(jù)中的數(shù)據(jù)，可能會(huì)存在誤差，但研究采用交叉分析的方法，尋找LY6E與胃癌放療敏感性的聯(lián)系，為實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)放療提供了參考依據(jù)，也為該類(lèi)其他研究提供了一些思路與線索。