810 nm半導體激光對豚鼠糖皮質激素依賴性皮炎的作用研究

馬 瓊，段靜嫻，王 燕，孫素姣，陳麗華

(大理大學臨床醫學院醫學美容學教研室，云南 大理 671000)

因糖皮質激素外用制劑及含激素類化妝品的濫用，臨床上糖皮質激素依賴性皮炎(下稱激素依賴性皮炎，corticosteroid addictive dermatitis，CAD)的發病率日益增多。以往的治療方法僅僅能在一定程度上緩解患者的主觀癥狀或客觀癥狀[1-2]，本研究采用低能量810 nm半導體激光治療激素依賴性皮炎，探索一種新的既能緩解患者的主觀癥狀，又能改善患者客觀癥狀的安全有效的方法。現報告如下。

1 材料與方法

1.1研究對象：選擇健康雄性豚鼠40只(大理大學實驗動物中心提供，滇實驗動物證第2016102號)，體重(200±50)g，隨機分為兩組，分別為模型組30只及空白對照組10只。分組飼養：對照組10只一籠、模型組30只分為10只、10只、10只三籠飼養。喂食標準兔飼料(大理大學實驗動物中心提供)，并定期補充Vit C預防足部潰瘍。所有動物自由攝食、攝水。

1.2制作激素依賴性皮炎豚鼠模型：參考潘煒華等[3]的豚鼠激素依賴性皮炎的動物模型制作方法，兩組實驗豚鼠采用自身對照法，以背部中線為界，所有實驗豚鼠用市售脫毛膏脫去約6 cm×6 cm皮膚作為實驗區，對照組左右兩側皮膚、模型組左側皮膚為對照區，模型組豚鼠右側皮膚脫毛后涂擦0.05%氯倍他索乳膏(昆明滇紅藥業有限公司)，2次/d，共涂藥60 d制造激素依賴性皮炎皮膚模型。

1.3810 nm半導體激光照射：造模成功后1周，將模型組豚鼠隨機分為模型組10只、試驗A組10只、試驗B組10只。每次激光照射前試驗組豚鼠對實驗區進行脫毛并固定體位拍照。通過預實驗測試光斑，確定激光的照射參數為：雙脈沖，能量密度8 J/cm2，脈寬為3 ms，脈沖延時為150 ms，治療頻率1 Hz，光斑直徑12 mm，冷卻頭16 mm×20 mm，每個部位可重復照射兩次。激光照射前先由兩名實驗人員固定豚鼠的四肢及頭部，充分暴露照光區皮膚，在治療區皮膚表面均勻的涂敷醫用冷凝膠，厚度大約為1 mm，然后使用上述參數做光斑測試。先觀察測試光斑的反應，治療時將治療頭垂直輕壓在凝膠上，對準皮膚，然后逐漸平行移動治療頭開始激光照射。試驗A組和試驗B組豚鼠采用相同的治療參數照射右側皮損區皮膚，試驗A組每周照射1次，試驗B組 2周照射1次，共進行三次激光照射。

1.4取材：分別于造模成功后一周模型組豚鼠(10只)切取皮膚樣本，固定液固定；試驗組A豚鼠(10只)于激光照射結束后一周切取皮膚樣本，固定液固定；試驗B組(10只)及對照組(10只)于激光照射結束后一周切取皮膚樣本，固定液固定。取材方法：脫毛后由實驗人員固定豚鼠以相對固定的體位拍照，5 ml無菌注射器抽取4%水合氯醛(大理大學第一附屬醫院制劑室配制)進行腹腔內注射麻醉，先用75%乙醇消毒背部皮膚，迅速用眼科剪剪取模型組、對照組、試驗A組及試驗B組激光照射區皮膚，大小為1×1 cm2，將皮膚樣本組織用生理鹽水沖洗表面積血后放入20 ml容器中，4%多聚甲醛固定并封口，并用記號筆標記分組及取材時間。固定的標本用石蠟包埋、切片，HE染色。

1.5結果判定

1.5.1表皮、真皮厚度測定：空白對照組、模型組、試驗A組、試驗B組四組切片隨機選取5個視野，光學顯微鏡下放大倍數為100倍及400倍，測量每個視野表皮、真皮的厚度，取其厚度的平均值作為表皮、真皮的厚度，單位為μm。

1.5.2炎性細胞數量的變化：空白對照組、模型組、試驗A組、試驗B組四組切片隨機選取5個視野，光學顯微鏡下放大倍數為100倍及400倍，計數中性粒細胞、淋巴細胞數量的變化。

2 結果

2.1肉眼大體觀察情況結果：見圖1。

圖1 對照組、模型組、試驗組A、試驗組B豚鼠皮膚外觀：①對照組，皮膚平整飽滿，無明顯紅斑、腫脹；②模型組，皮膚出現明顯的紅斑、腫脹、皺紋；③試驗A組，皮膚飽滿、紅斑消退，皺紋減少；④試驗組B，皮膚飽滿、紅斑消退，皺紋減少

2.2HE染色結果：對照組表皮層細胞排列整齊，真皮層膠原纖維排列整齊、致密，染色均一(見圖2中①②)。模型組表皮變薄，細胞層數減少，排列紊亂，角質層上皮細胞角化不全；顆粒層變薄，見細胞變性、壞死，部分胞核碎裂，棘突變平。真皮層可見真皮淺層毛細血管擴張、數量增加，真皮血管周圍可見較多的淋巴細胞、中性粒細胞浸潤；真皮層膠原纖維數量減少，纖維排列紊亂、疏松(見圖2中③④)。試驗A組、試驗B組與模型組相比表皮細胞層數增加，表皮增厚；真皮乳頭層見較多的成纖維細胞，真皮網狀層與模型組相比，膠原纖維數量增加，排列整齊、致密，染色增強，真皮層明顯變厚(見圖2中⑤～⑧)。模型組與對照組比較，真皮淺層淋巴細胞數量增多，試驗A組、試驗B組與模型組比較，真皮淺層淋巴細胞數量減少，中性粒細胞數量減少(見圖2中⑥、⑧)。

圖2 對照組、模型組、試驗組A、試驗組B豚鼠皮膚HE染色

組別例數表皮厚度(μm)真皮厚度(μm)淋巴細胞(/HP)中性粒細胞(/HP)對照組1027.60±1.09156.88±7.365.00±5.556.00±5.79模型組1020.87±1.11102.79±6.5445.00±7.4347.00±6.37試驗A組1024.37±1.15130.68±7.5113.00±7.5214.00±7.15試驗B組1025.12±1.37146.54±6.7926.00±6.5727.00±6.45

注：以上結果均在高倍×400下測得

3 討論

實驗證實如果皮膚局部長期使用強效糖皮質激素超過6周，就能導致皮膚表皮的角質形成細胞體積縮小，角質層的細胞層數減少，鏡下只有2～3層細胞，而且細胞的結構也發生了異常；此外角質層透明層顆粒層細胞形成減少，最終使角質層變薄，甚至缺失[3]。從表1中可以看出，模型組豚鼠在使用強效激素60 d后，表皮層細胞層數較對照組減少，厚度變薄；真皮層成纖維細胞數量減少，膠原纖維數量減少，排列紊亂，真皮厚度較對照組變薄，差異有統計學意義(P<0.05)。

810 nm激光屬于遠紅外光，使用多脈沖(雙脈沖)、長脈寬(150 ms)、低強度功率(10 J/cm2)激光作用于人體可產生一系列生物刺激效應：波長>630 nm的紅光，其穿透組織的深度較深，能夠直接作用于皮膚的真皮層。Grossman等使用波長780 nm、能量密度為0.5 J/cm2的激光照射試管內的成纖維細胞，證實其能夠顯著促進成纖維細胞的增殖[4]；馬長升等應用650 nm低能量半導體激光照射家兔皮膚傷口，也證實該波長的低能量激光刺激能夠促進成纖維細胞的增殖而促進傷口的愈合[5]。以上都為本研究選擇810 nm半導體激光治療激素依賴性皮炎導致的皮膚萎縮提供了理論依據。

表1中，模型組豚鼠表皮在強效激素0.05%的氯倍他索作用下表皮細胞層數減少、變薄，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。810 nm半導體激光照射后，試驗組A豚鼠的表皮細胞層數增加，厚度增厚，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；試驗組B豚鼠的表皮細胞層數增加，厚度增厚，與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，但試驗組A與試驗組B比較，表皮增厚程度差異無統計學意義(P>0.05)。表1中模型組豚鼠真皮在藥物作用下真皮層成纖維細胞數量減少，膠原纖維數量減少，排列紊亂，導致真皮厚度變薄，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。810 nm半導體激光照射后，試驗組A真皮層見較多的成纖維細胞，與模型組相比膠原纖維數量增多，排列整齊、致密，差異有統計學意義(P<0.05)。試驗B組真皮層見較多的成纖維細胞，與模型組相比膠原纖維數量增多，排列整齊、致密，與模型組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。試驗B組與試驗A組比較，真皮增厚更加明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。以上實驗結果說明，低能量810 nm半導體激光照射激素依賴性皮炎豚鼠模型皮膚后，均能使其表皮厚度增加，但治療間隔時間對其影響不大；低能量810 nm半導體激光治療也均能使豚鼠模型皮膚真皮層的成纖維細胞增多，膠原纖維數量增多，排列更加致密和整齊，但試驗組B治療間隔時間為兩周，較試驗組A治療間隔時間為一周真皮厚度增加更為明顯，說明激光治療對真皮的膠原纖維作用時效性可以一直延續，而且低能量的激光照射可產生良性的生物刺激，可見810 nm半導體激光在對激素依賴性皮炎導致的皮膚萎縮的治療過程中治療間隔為兩周更為適宜。

Yano等、米新賓等在研究中發現，低強度激光并沒有直接殺滅細菌的作用，但其可通過增加淋巴因子和溶菌酶的活性刺激吞噬細胞，抑制粒細胞的功能，從而起到抑制細菌作用，而且低強度激光的抑菌作用主要還和激光照射的強度、照射的時間和照射的次數有直接的關系[6-7]。當激光照射達到一定數值的能量密度時，就能夠起到抑制細菌生長的作用。所以使用低強度激光照射在臨床上治療炎性疾病并不是通過直接殺滅細菌來達到治療目的，而是通過低強度激光的光化學作用來實現其對炎癥性疾病的治療。Yano等通過實驗證明低強度激光一方面能直接抑制部分細菌的生長[6]；另一方面通過低強度激光照射可提高溶菌酶和溶酶體酸性磷酸酶活性，增強巨噬細胞的吞噬功能，提高特異性和非特異性免疫的作用[8]。

表1中，模型組豚鼠與對照組相比，相同視野下，模型組炎性細胞(中性粒細胞和淋巴細胞)明顯增多，差異有統計學意義(P<0.05)，說明長期使用激素或含激素類藥物或化妝品均能使炎性細胞浸潤的數量增加，從而導致皮膚產生炎性反應，使患者在臨床上出現瘙癢、紅腫、腫脹等癥狀。模型組A及模型組B在經過低強度激光照射后，相同視野下，真皮層中中性粒細胞和淋巴細胞數量較模型組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)。根據上述低強度激光對于皮膚炎性反應的治療機制，說明低能量810 nm半導體激光對于激素依賴性皮炎所引起的炎細胞浸潤能夠起到一定的治療作用。表1中，試驗A組與試驗B組相比較，試驗A組炎性細胞數量的減少較試驗B組更為明顯，差異有統計學意義(P<0.05)，說明在激素依賴性皮炎的炎性反應急性期，縮短兩次激光治療的間隔時間(即一周激光照射一次)更能明顯減輕炎性反應。可見810nm半導體激光在對激素依賴性皮炎導致的急性期炎性反應的治療過程中，治療間隔時間為一周更為適宜。

低能量810 nm半導體激光可刺激豚鼠激素依賴性皮炎表皮角質形成細胞的增殖，使角質形成細胞的層數增加，表皮層增厚，并可促進真皮成纖維細胞數量的增加，使膠原纖維數量增加，使真皮層增厚，對于激素依賴性皮炎所導致的皮膚菲薄萎縮及皮膚屏障的修復治療間隔周期為兩周更為適宜。低能量810 nm半導體激光可減少豚鼠激素依賴性皮炎炎性細胞浸潤的數量，且在皮炎的急性期重復治療間隔周期設定為一周更為適宜。