煙草SMC1A基因克隆、表達載體構建及表達分析

盧健榮

摘 要：采用同源克隆的方法對煙草品種K326中的一個SMC1A基因進行了研究，組織表達分析發現，該基因在成熟期的根、莖、葉、花中均有表達，在根中的表達量最高。有研究表明，該基因的穩定表達對低鉀、高鹽、干旱、ABA均有響應表達，試驗成功構建了pET32a-SMC1A過表達載體。研究結果能為解析SMC1A在響應逆境脅迫的功能奠定一定理論

基礎.

關鍵詞：煙草SMC1A 克隆 生物信息學 基因表達

染色體結構維持蛋白（SMC蛋白，structural maintenance of chromosome proteins），與染色體結構細胞周期性的動態變化緊密相關，它們參與有絲分裂染色體的集縮和分離、性染色體的劑量補償效應、姐妹染色單體的內聚作用、遺傳重組和DNA修復等過程[1]，具有一定的結構保守性，可作用于染色體代謝的多個方面。

SMC蛋白普遍存在于各種生物中，盡管不同種類SMC蛋白的結構有差異，但是它們具有一定的保守性[2]。通常，SMC蛋白是由1000到1500個氨基酸殘基組成的多肽并具有共同的結構特征：N端核苷結合基序，中間兩個被鉸鏈隔開的螺旋區（可能與蛋白質之間的相互作用有關），C端被命名為DA盒的保守序列。DA盒與ATP酶的特征基序非常相似，DA盒和N端ATP結合區共同組成ATP酶功能域，因此SMC蛋白是一類染色體ATP酶。

許多原核生物（包括細菌、古細菌）也具有編碼SMC蛋白的基因。革蘭氏陽性細菌枯草桿菌SMC基因的突變會導致無類核細胞的形成、類核結構的破壞以及與染色質分離相關的蛋白復合物的錯誤組裝，這說明枯草桿菌的SMC基因產物與類核物質的壓縮直接相關[3～5]。

SMC蛋白與染色體行為密切相關，它與不同亞基結合在多個方面影響染色體，本實驗擬通過克隆煙草SMC1A基因，分析進行其遺傳特性學及其生物信息學特性分析，為研究煙草基因組穩定性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

煙草品種K326；原核表達載體pET-32a（+）；rans5α化學感受態細胞和BL21（DE3）化學感受態細胞（購自北京全式金生物技術有限公司）；T4 DNA Ligase、EcoR I-HF?和Not I-HF?限制性核酸內切酶（New England Biolabs（NEB）公司 ）；膠回收試劑盒和質粒小提中量試劑盒 （天根生化科技（北京）有限公司）

1.2方法

1.2.1 SMC1A基因引物設計與合成

參考NCBI GenBank基因庫中SMC1A（NM_019710.2）基因序列設計引物，引物設計如下：

MC1A-F：ATGGGTTTCCTGAAACTGAT

MC1A-R：GCTATTGTTCATTGGGGTTGG

所設計引物送生物公司進行合成。取煙草品種K326葉子，提取總RNA，進行反轉錄PCR（reverse transcription-PCR， RT-PCR），轉錄成cDNA，保存于-80℃冰箱。

通過PCR擴增其基因，克隆至質粒載體，對克隆得到的編碼基因進行PCR鑒定及測序鑒定。具體體系和反應條件如表1所示。

反轉錄成cDNA后，參照2×TransTaq High Fidelity（HiFi） PCR SuperMix Ⅱ說明書的體系要求分別加入試劑，具體試劑參見表2所示。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。條帶正確則將目的位置PCR產物電泳條帶膠回收純化，膠回收方法具體操作參考天根膠回收試劑盒說明書進行。

1.2.2重組質粒的構建及鑒定

1.2.2.1 目的基因與表達載體連接

將轉有原核表達載體pET-32a（+）的細菌過夜培養，提取pET-32a（+）載體質粒，提取方法見說明書。取pET-32a（+）質粒和純化后的PCR產物，分別加入預先準備好的EcoR I-HF?和Not I-HF?限制性內切酶進行雙酶切，反應條件為37℃ 4 h，65℃ 15 min，具體體系和反應條件參考表3和表4。反應結束后，對產物進行瓊脂糖凝膠電泳，并參考天根膠回收試劑盒對產物進行純化，具體操作參考說明書進行。回收后的樣品按摩爾比，載體：插入的DNA=1：7的比例加入，并添加1μL T4 DNA Ligase和2μL 10×buffer，1μL Nuclease-Free Water，總體系為20μL。置于4℃過夜反應。

1.2.2.2 轉化

反應結束后，向反應液中加入50 μL Trans5α化學感受態細胞，反應條件為冰浴20～30 min，42℃熱激1 min 30 s，冰浴2 min，然后加入200 μL無氨芐青霉素LB液體培養基，于搖床上37 ℃，200 rpm培養1-2 h，再將菌液涂布于含氨芐青霉素LB固體培養基上，置于37 ℃培養箱中過夜培養。第二天進行陽性菌的篩選。

1.2.2.3 重組質粒的PCR鑒定

陽性菌落的篩選，首先進行PCR鑒定，將SMC1A基因和載體T7引物進行組合，分別是SMC1A上游引物SMC1A- F與SMC1A下游引物SMC1A-R、載體上游引物T7 F與載體下游引物T7 R、SMC1A上游引物SMC1A-F與載體下游引物T7 R和SMC1A下游引物SMC1A-R與載體上游引物T7 F等四種組合方式。

1.2.2.4 重組質粒的酶切鑒定及測序結果分析

鑒定正確后，將菌液加入到含氨芐青霉素的LB液體培養基中過夜培養。培養完成后，將菌液分成兩部分，一部分菌液按1：1的比例加入60%的甘油用于保種，一部分菌液提取質粒，進行酶切鑒定和測序鑒定。測序結果先進行NCBI GenBank庫比對，確定其正確性，然后利用軟件DNAMAN翻譯成氨基酸序列，再進行生物信息學分析。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果

PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后，如圖1結果顯示，在第1泳道750bp和1000bp間有一清晰條帶，大小與預測大小一致，說明該對引物可特異性擴增出目的基因。

2.2 重組質粒PCR鑒定結果

挑取培養板上的菌落進行PCR鑒定，PCR產物電泳結果如圖2所示，表明在兩對引物的組合擴增下，所選菌落在預測位置分別出現相應的PCR片段，說明目的基因插入到表達載體的相應位置。

2.3 重組質粒酶切鑒定結果

重組質粒在雙酶切消化反應后，經瓊脂糖凝膠電泳可見，EcoR I-HF?和Not I-HF?酶切的1泳道中出現兩條條帶，一條大概為820 bp左右與SMC1A基因擴增大小一致，另一條大小大概5789 bp是載體酶切后的片段；在兩個酶分別單酶切消化反應的泳道2和3中，均只出現一個條帶，大小約為6691 bp；在無酶切消化反應的泳道4中，由于質粒的特殊結構，一般出現二到三個條帶，結果如圖3所示。以上結果初步說明含有目的基因的重組質粒構建成功。

2.4 重組質粒測序鑒定及基因生物信息學分析

對測序結果進行分析，根據酶切位點位置，將其中的目的基因挑出，基因片段大小為810bp，基因序列如圖4所示，并與NCBI GenBank在線比對分析。建立遺傳進化樹，由同源性分析發現，克隆的SMC1A基因與ZJ99株及MW9710株的同源較高，結果如圖5所示，說明本實驗成功克隆SMC1A基因，序列已上傳至NCBI GenBank（ID： KX831117.1）。

3討論

本實驗通過查找基因庫，初步克隆煙草品種K326中的SMC1A基因，成功克隆SMC1A基因，并分析得到其遺傳特性及其遺傳進化樹。對其抗原表位、信號肽、跨膜區域、糖基化位點及磷酸化位點等生物信息學特性有一定的了解。相關研究表明，SMC1A基因的穩定表達對低鉀、高鹽、干旱、ABA均有響應表達，實驗成功構建出pET32a-SMC1A表達載體，能為解析SMC1A在響應逆境脅迫的功能奠定一定理論

基礎。

參考文獻：

[1] Diebold-Durand ML，Lee H，Ruiz Avila LB et al.Structure of Full-Length SMC and Rearrangements Required for Chromosome Organization[J].Mol Cell，2017，67（2）：334-347.

[2] 彭莉，張飛雄.SMC蛋白的結構和功能[J].遺傳，2001，23（2）：173-176.

[3] Hirno T，T J Mitchison. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome eondensation in vitro[J].Cell，1979：449-459.

[4] Chuang P T，Albertson D G，Meyer B J.DPY-27：A chromosome condensation protein homolog that regulates C.elegams dosage compensation through association with the X chromosome[J].Cel1.1994，79：459-474.

[5] Uhlmana F，Nasmyth K.Cobesion between sister chromasides must be establisbed during DNA replication[J] Curr Bio1.1998，8：1095-1l0l.