CRISPR/Cas技術在核酸檢測中的應用進展

史 鎧，雷春陽，聶 舟

(湖南大學 化學生物傳感與計量學國家重點實驗室，化學化工學院，湖南 長沙 410082)

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是大多數細菌及古細菌中抵御病毒入侵的一種獲得性免疫方式。CRISPR/Cas系統的發現可以追溯到1987年，Nakata等[1]首次在大腸桿菌的基因組中發現了串聯的間隔重復序列，但在當時并未引起學術界的關注。2002年，Jansen等[2]將這一奇特的重復間隔序列正式命名為串聯間隔短回文重復序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。2005年，Bolotin等[3-4]發現這些重復間隔序列來源于外援入侵的噬菌體的基因，推測CRISPR/Cas系統可能與細菌的免疫系統有關。直至2011年，Koonin等[5-7]才揭示了CRISPR/Cas系統介導的免疫機理：當病毒首次入侵時，細菌會將病毒的小片段DNA整合到自身的CRISPR間隔區；病毒再次入侵時，CRISPR轉錄生成一條前體CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后pre-crRNA被RNA內切酶切割生成含有與病毒靶標序列匹配的成熟CRISPR RNA(crRNA)。該crRNA引導具有核酸內切酶活性的Cas蛋白(CRISPR-associated proteins)對靶標序列進行識別和降解。其中Cas蛋白對靶標序列的識別必須依賴于原型間隔序列毗鄰基序(Protospacer adjacent motif，PAM)，因此PAM在CRISPR/Cas系統中起著至關重要的作用。按Cas蛋白的組成,CRISPR/Cas系統可分為兩大類：第一大類的Cas蛋白為多亞基組成的多蛋白效應復合物，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第二大類的Cas蛋白為單個效應蛋白，包括Ⅱ型的Cas9、Ⅴ型的Cas12和Ⅵ型的Cas13[8-9]。2012年，Doudna等[10]證實結合crRNA的Cas9可在體外條件下與基因組中DNA靶序列的特定位點結合并切割，由此揭開了將CRISPR/Cas系統改造為基因編輯工具的序幕。利用經過改造的CRISPR/Cas系統，研究者能夠精確、高效地對基因組進行切割、替換或添加。近年來，科學家發現部分Ⅱ類Cas蛋白具有附屬切割活性，并將其應用于核酸快速檢測領域，取得了顯著的成就[11-13]。本文主要介紹CRISPR/Cas系統在核酸檢測領域的最新進展，主要涉及Cas9、Cas12a(又名Cpf1)和Cas13a(又名C2c2)3種Ⅱ類Cas蛋白(見表1)在病毒快速檢測、癌癥標志物的早期診斷以及遺傳性疾病的診斷等領域的應用[11-14]。

表1 3種用于核酸檢測的Cas蛋白的性質Table 1 The property of the Cas proteins used for nucleic acid detection

1 Cas9輔助的特異性診斷系統

基于CRISPR/Cas優異的序列識別能力，著名的合成生物學家Collins首次將CRISPR/Cas技術引入核酸分子診斷[14]，開發了一種用于低成本區分寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)亞型的紙基傳感器。該傳感器由3個步驟組成：擴增、ZIKV檢測和CRISPR-Cas9輔助的毒株鑒別。從樣本中提取RNA靶標并進行擴增，然后將擴增產物滴加到含有凍干細胞組分和生物蛋白的紙片上，激活凍干組分產生生化反應，使紙片發生肉眼可見的顏色變化(黃→紫)，從而指示ZIKV的存在。ZIKV和登革熱病毒(Dengue)因臨床癥狀相似而很難辨別[15]，在該檢測平臺的幫助下，研究者可在3 h內確定患者感染的病毒類型。如果檢測到ZIKV，第3步將樣品與凍干的CRISPR-Cas9混合。利用CRISPR-Cas9對PAM區域優異的序列識別能力，該檢測平臺可精準區分不同亞型的ZIKV。這種檢測系統能在現場準確地進行毒株特異性的診斷，可能對實時追蹤病毒流行病擴散和制定遏制策略與治療計劃的國家和全球衛生機構非常有價值。

2 Cas13a在核酸檢測中的應用

2016年6月，張鋒等[9]報道了一種Ⅱ類Ⅵ型CRISPR效應蛋白Cas13a。Cas13a是一種在crRNA引導下與靶標RNA特定位點結合并切割的核酸內切酶。從結構上看，Cas13a含有兩個負責切割靶標單鏈RNA的HEPN結構域。同年10月Doudna研究組[11]發現LeptotrichiabuccalisCas13a(LbuCas13a)不僅具有對靶標RNA切割活性，而且還具有切割非靶標RNA的活性，這種非特異性切割后來被稱為附屬切割[12]。利用這種附屬切割活性，該研究組將Cas13a用于RNA靶標檢測，其檢出限約10 pmol/L。但是對大多數核酸的檢測方法，檢出限達到amol/L數量級才具有實際應用價值[16]。2017年，張鋒課題組與 Collins合作[12]將LeptotrichiawadeiCas13a(LwCas13a)與重組酶聚合酶等溫擴增技術(Recombinase polymerase amplification，RPA)結合，開發了一個基于高特異性和靈敏性的酶解鎖報告探針(Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing，SHERLOCK)的核酸檢測系統。在該檢測系統中(圖1)，靶標核酸分子經RPA和T7 RNA聚合酶轉錄擴增后，激活LwCas13a的附屬切割活性，切割底物產生熒光信號。引入RPA顯著提高核酸檢測靈敏度，SHERLOCK對靶標的檢出限低至2×103copies/mL(3.2 amol/L)，實現了單個核酸分子的檢測。該研究組還構建出一種基于SHERLOCK試紙的快速、低成本的便攜式核酸診斷工具，利用這套系統成功識別出腫瘤特有的突變，鑒定了人類基因組中的多個單核苷酸多態性。這項重磅研究成果再次證實了CRISPR/Cas核酸診斷領域的應用價值，有望對全球公共衛生產生革命性的影響。自然界中核糖核酸酶(RNase)廣泛存在且十分穩定，而SHERLOCK系統的關鍵組分均為RNA，因此該系統對操作環境要求較為苛刻。

3 Cas12a在核酸檢測中的應用

2015年，張鋒等[17]發現一種Ⅱ類Ⅴ型CRISPR效應蛋白Cas12a。Cas12a可在crRNA引導下與靶標雙鏈DNA結合并切割基因組DNA，該crRNA的長度為42～44個堿基，與Cas9系統相比簡化了實驗設計。2018年，Doudna等[13]發現當Cas12a特異性結合和切割目標dsDNA后，具有類似Cas13a的非特異性切割單鏈DNA(ssDNA)的活性，并利用Cas12a的該附屬切割活性開發了一個基于DNA內切酶靶向CRISPR非特異性的報告探針(DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter，DETECTR)的核酸檢測系統。與SHERLOCK類似，DETECTR將RPA與Cas12a相結合，擴增產物激活Cas12a的附屬切割活性，切割底物產生熒光信號(圖2)。DETECTR能夠從感染多種不同人乳頭瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)亞型的樣本中準確檢測出高風險的HPV16和HPV18，在單核苷酸多態性分析、癌癥篩查、細菌和病毒感染檢測以及耐藥性篩查等方面有廣泛的應用潛力。DETECTR系統中靶標及底物均為DNA，其穩定性較強，因此該系統對實驗操作環境要求低，可應用于現場的快速檢測。

圖1 用于檢測單分子水平核酸的診斷平臺-SHERLOCK[12]Fig.1 Single-molecule nucleic acid detection based on SHERLOCK[12]

4 Cas13/Cas12a在多靶標檢測中的應用

圖3 基于Ⅱ類CRISPR-Cas蛋白附屬切割活性的SHERLOCK v2系統[18]Fig.3 Multiplexed detection of SHERLOCK based on the orthogonal collateral activity of type Ⅱ Cas proteins[18]

SHERLOCK和DETECTR系統雖可快速、靈敏地檢測核酸分子，但存在一些局限，例如一次只能檢測一種核酸、依賴于熒光設備讀取信號等。針對以上缺點，張鋒等[18]發展了第二代SHERLOCK(SHERLOCK v2)系統，在保持快速、便捷和低成本等優點的基礎上，實現了一次分析同時檢測4種不同靶標。SHERLOCK v2由3種底物特異性的Cas13蛋白(LwaCas13a，PsmCas13b和CcaCas13b)和Cas12a組成，每種核酸靶標的擴增產物激活對應Cas蛋白切割其特異性底物，產生多色熒光信號，以實現對不同核酸靶標的熒光響應(圖3)。ZIKV和Dengue因臨床癥狀相似而很難辨別[15]，使用SHERLOCK v2能夠在單一反應中同時檢測出樣本是否含有ZIKV或Dengue病毒。除檢測靶標數量的提升，SHERLOCK v2還引入CRISPR相關酶(Csm6)進一步放大檢測信號，使得該工具的靈敏度較最初版本提高了3.5倍，這對檢測血液樣本中循環腫瘤DNA等低豐度的靶標尤為重要。該研究組進一步開發出基于SHERLOCK v2系統的試紙條，在無需復雜儀器輔助的情況下，實現了肉眼觀察檢測結果。經過改進的SHERLOCK v2不僅實現了多靶標同時檢測，而且提供了更高的靈敏度和更便利的檢測結果讀取方式。

5 總結及展望

SHERLOCK和DETECTR系統在核酸診斷方面卓越的表現，證明了CRISPR/Cas技術不僅具有強大的基因編輯能力，而且在分子診斷領域有重要的應用價值。目前，分子診斷一般包括病原的分離、核酸的提取與擴增、檢測結果分析等過程，耗時長且對醫療設備和操作人員的專業水準要求很高[19-20]。SHERLOCK和DETECTR系統不需依賴貴重設備和醫護人員經驗，將給缺乏先進設備和訓練有素人員的發展中國家帶來很大便利，具有影響人類健康和全社會的真正潛力。雖然SHERLOCK和DETECTR已展現出它們在診斷中的強大力量，但在進入臨床使用前，尚需進一步研究以確保診斷的準確性。此外，CRISPR/Cas技術在小分子和蛋白質等生物大分子檢測方面的應用也亟待開發。隨著對Cas蛋白研究的深入以及更多Cas蛋白被發現，CRISPR/Cas系統將在POCT(point-of-care testing)領域有著巨大的應用前景。