Kisspeptin 1基因單核苷酸多態性與生長激素缺乏性侏儒癥的相關性研究

姜書琴，王 偉，陸文全，羅向陽

生長激素缺乏性侏儒癥（growth hormone deficiency dwarfism，GHDD）是由于腺垂體合成和分泌生長激素部分或完全缺乏，或由于生長激素分子結構異常等所致的生長發育障礙性疾病。其發病機制涉及激素、環境、遺傳等多方面，其中遺傳約占 75%［1］。 Kisspeptin 1（Kiss－1）基因（腫瘤轉移抑制基因），主要依靠Kp/GPR54系統對機體起調控作用［2］，有研究發現 kiss－1 基因可以調控生長激素（GH）的分泌，其多態性改變與身高存在一定的相關性［3］。迄今為止，全基因組關聯研究（genome wide association study，GWAS）已經發現人類的身高至少與180個基因位點有關，可以解釋10%的身高變異［4］，基于 GWAS 研究結果，選取 Kiss－1 基因的 C.－89（rs3924587）及 c.－145（rs5780218）共 2 個單核苷酸多態性（SNPs）位點，探討河南地區GHDD患者與Kiss－1基因單核苷酸多態性的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）GHDD組。隨機選取2017年07月—2017年11月在鄭州大學第三附屬醫院兒科內分泌中心就診的GHDD患者60例 （其中男30例，女 30 例），平均年齡（7.4±1.4）歲。 納入標準：①身高落后于同年齡、同性別正常健康兒童身高的第3 百分位數｛減 1.88 個標準差（－1.88）｝或減 2 個標準差 （－2 s以下）（參照2005年中國兒童身高標準）；②年生長速率＜5 cm/年；③勻稱性矮小，面容幼稚；④無慢性器質性疾病、染色體異常等；⑤骨齡落后于實際年齡；⑥兩種GH藥物激發實驗GH峰值均＜10μg/L； ⑦性成熟分級 （sexual maturityrating，SMR），也稱為Tanner分期，為1期：女孩乳房為幼兒型，男孩睪丸直徑＜2.5 cm（超聲測量）及 Prader睪丸計測定的睪丸容積1～3 ml，患者均無陰毛發育。（2）對照組。隨機選取同期在鄭州大學第三附屬醫院體檢的同年齡同性別青春期前健康兒童60例（其中男 30 例，女 30 例），平均年齡（7.4±1.4）歲。納入標準：①身高在同年齡同性別正常人的±1SD之間；②無內分泌代謝及慢性器質性疾病。該研究經醫院倫理委員會批準，所有研究對象及其家屬均簽署知情同意書。（3）檢測指標。GHDD組患者需定期監測身高、體重、肝腎功能、甲狀腺功能、血糖、血清IGF－1水平及骨齡。（以上操作由經過培訓的專業人員操作，生化指標采用化學發光方法進行）

1.2 實驗方法 （1）采集標本。于早晨空腹收集所有研究對象外周靜脈血2 ml，放入含EDTA的真空采血管中，－80℃冰箱保存備用。（2）遺傳分析。使用全血 DNA 提取試劑盒（Kurabo，Osaka，Japan）提取所有研究樣本的基因組DNA，對DNA濃度及純度進行檢測后－20℃冰箱保存備用。使用南京金斯瑞生物科技公司設計合成的引物進行目的片段的PCR擴增。引物序列如下：

引物rs3924538

F：GGCCTGTGCTTGGAGACGTCAC

R：GTGTGCCAGTCTTAGATTTCCACCA

引物rs5780218

F：GTGTTGCAAAGCCATCTTTC

R：TCTTTTATTGCCTCGGGTTG

PCR 擴增總為 50μl，包括 12μl滅菌水、25μl 2×PCR Buffer for KOD、5μl 2mM dNTPs、2μl 25mM MgSO4、 引物各 1μl （10μM each）、3μl模板、1μl KOD （1 U/μl）。 PCR 設定的條件為：94℃預變性2 min，98℃變性 10 s，55℃退火 30 s，68℃延伸 60 s，共35個循環，PCR產物4℃保存。

在瓊脂糖凝膠電泳上分離純化PCR產物，隨后采用 3730xl毛細管測序儀 （Applied Biosystems，Waltham，MA，USA）進行測序?；蛐头治鍪褂肎enemapper軟件（v.4.0；Applied Biosystems）。

1.3 統計學處理 利用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，計數資料以例數和%表示，采用χ2檢驗比較GHDD組與對照組基因型分布及等位基因頻率差異；采用擬合優度χ2檢驗進行遺傳平衡檢驗，P＞0.05 認為基因型分布符合 Hardy－Weinberg 平衡。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg（HWE）平衡 比較 GHDD組與對照組rs3924587及rs5780218位點基因型的理論值與實際值，結果顯示 P＞0.05，符合 HWE，該研究樣本的群體代表性較好。見表1。

表1 兩組rs3924587及rs5780218位點基因型理論值與實際值比較

2.2 兩組kiss-1基因SNPs位點基因型及等位基因頻率比較 （1）rs5780218位點基因型分布頻數：GHDD 組 T/T、C/T、C/C 分布頻數分別為 17、22、21例；對照組T/T及C/T、C/C分布頻數分別為19、20、21 例。 兩組在基因型構成比（χ2=2.412，P=0.120）和等位基因頻率（χ2=2.340，P=0.126）上差異均無統計學意義。（2）rs3924587位點基因型分布頻數：ISS組G/G、G/A 及 A/A 分布頻數分別為 20、22、18例；對照組 G/G、G/A及 A/A分布頻數分別為 22、18、20例。 兩組在基因型構成比（χ2=1.336，P=0.513）和等位基因頻率（χ2=1.053，P=0.305）上差異均無統計學意義。見表2及圖1、2。

表2 Kiss-1基因rs5780218及rs3924587位點基因型分布頻數

圖 1 兩組rs3924587位點基因型條形圖

圖 2 兩組rs5780218位點基因型條形圖

3 討論

GHDD主要是由于下丘腦－垂體功能障礙等造成生長激素分泌不足，導致生長遲緩，1996年Lee等首次發現腫瘤轉移抑制基因（Kiss－1基因），該基因在啟動青春期生長發育、調控能量平衡及生物節律等方面具有重要作用。既往研究報道Kiss－1基因可參與生長激素（GH）的釋放過程，用kisspeptin處理體外培養的大鼠和牛垂體細胞，可以促進GH分泌，提高血清中 GH 濃度［5］。 Kiss－1 基因表達、青春期啟動、GH分泌成倍增加，青春期身高突增，生長發育加速，其作用機制是：下丘腦不同核區分泌的Kisspeptin與其受體結合，再通過下丘腦－垂體－性腺軸（hypothalamic－pituitary－gonadal axis，HPGA）的調控作用，引起性激素分泌增多，再通過負反饋調節機制使GH分泌增加，進而促進機體縱向生長［6］。

性早熟 （precocious puberty，PP） 主要是由于HPGA功能過早啟動，促性腺激素釋放激素（gonadotropin hormone，GnRH）脈沖分泌增強，出現第二性征發育、機體線性生長和骨齡迅速增加。生長發育是由GH和性激素（sex hormone，SH）協同作用的結果，PP也會導致身材矮小。既往研究發現矮小癥患者經rhGH治療可改善其性腺功能，可通過延緩誘導其青春發育年齡的方法，改善其終身高。國內外研究發現，Kiss－1基因單核苷酸多態性與性早熟的發生密切相關，Kiss－1基因被認為是性早熟的保護性基因［7］。在朝鮮、巴西、伊斯法罕地區PP患者及喪失青春發育進程的同家族成員中均發現存在 Kiss－1 基因的單核苷酸多態性改變［8－10］。 性早熟和單純乳房早發育患者血清kisspeptin水平較正常女童顯著增高［11，12］。身高的增長與骨骼生長板密切相關，性早熟患者大多身高增長加速，骨礦物質含量及骨密度明顯增高，基于生長板功能在GHDD中的重要作用，由此推測GHDD與性早熟發病機制可能存在交叉點。

隨著分子生物學及檢測手段的不斷發展，任何生長相關基因的單核苷酸多態性都可能與GHDD的發生有關，筆者推測，Kiss－1基因單核苷酸多態性與GHDD存在相關性，其可能機制是Kiss－1基因特異性位點的多態性造成表達蛋白的氨基酸序列不同，影響青春期的生長，從而導致終身高具有差異性。 該研究以 Kiss－1 基因 c.－145（rs5780218）和 C.－89（rs3924587）位點為切入點，發現對照組及GHDD組患者中均未檢測到任何多態性改變，在GHDD組患者中兩個SNP位點基因型構成比及等位基因頻率與對照組相比差異均無統計學意義（P＞0.05）， 結 果提 示 rs5780218 和 rs3924587 位 點 與GHDD的發生可能不存在相關性，等位基因A、G、C、T既不是GHDD的保護性基因，也不是GHDD的易感基因，在降低GHDD的發病風險及預防等方面無明顯作用，由此推測Kiss－1基因單核苷酸多態性可能與GHDD無相關性，但由于該研究對象均為河南地區GHDD患者，樣本量少，種屬不同，地區特征明顯，該結論目前只在河南地區GHDD患者中成立，對于其他地區攜帶相關等位基因的患者需警惕GHDD的發生風險，需定期監測身高變化情況，從而可以在最佳治療時間進行針對性治療，避免延誤病情。矮小癥病因復雜多樣，種屬不同及地域差異等均可對研究結果產生影響，可通過擴大樣本量等方法設計進一步的研究，或通過對Kiss－1基因相關位點基因編碼的蛋白及其功能做進一步的研究，以便更深層次地探討Kiss－1基因單核苷酸多態性與GHDD的相關性。

綜上所述，Kiss－1基因rs5780218及rs3924587位點多態性與GHDD的發生無明顯相關，但此次樣本數量較少，有地區特性，該結論只在河南地區GHDD患者中成立。