人造血干細胞在不同溫度下生長、凋亡的實驗研究*

楊 鑫，周曉紅

(重慶大學附屬腫瘤醫院/重慶市腫瘤研究所/重慶市腫瘤醫院，重慶 400030)

人造血干細胞(HSCs)具有自我更新能力并能分化為各種血細胞前體細胞，最終生成各種血細胞成分(包括紅細胞、白細胞和血小板)，HSCs也可以分化成其他細胞。有研究者在1961年通過“脾集落形成試驗”，首先描述了HSCs的特性。威斯康星大學的THOMSON等[1]在1988年成功建立了胚胎干細胞系。在此之后，HSCs被進一步分化為神經細胞、造血細胞、肌肉細胞、胰島細胞、心肌細胞、內皮細胞等[2-5]。HSCs良好的分化增殖能力對患者損傷組織的修復具有重要意義,使得干細胞能更加廣泛地應用于臨床。溫度在細胞的培養條件中至關重要，有研究發現溫度環境對細胞的生長和凋亡有影響[6-9]。目前關于溫度影響HSCs生長和凋亡方面的報道較少。因此，本研究以溫度作為干預條件，觀察不同溫度下體外培養HSCs的生長及凋亡情況，為進一步科研和臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料 上海拜沃生物科技有限公司提供HSCs。

1.2儀器與試劑 RPMI1640培養液(上海元龍生物技術有限公司)，IMDM培養基(GIBCO公司)，Metho CultTMHCC4230培養基(加拿大Stem cell Technologies Inc公司)，Annextin V(美國Becton,Dickinson and Company)，二氧化碳培養箱(美國Thermo Fisher公司)，LHC-250-Ⅰ恒溫恒濕二氧化碳培養箱(北京陸希科技有限公司)，CKC-TR-2W型倒置顯微鏡(Olympus公司)，YJ-875型超凈化工作臺(蘇州安泰凈化設備廠)，6孔培養板(北中杉金橋生物技術有限公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)，BD-CAN7型流式細胞儀(美國 Becton,Dickinson and Company)。

1.3方法

1.3.1細胞培養 HSCs采用10%胎牛血清的RPMI1640培養液培養。

1.3.2不同溫度的細胞培養處理 將HSCs分成實驗組和對照組。實驗組細胞在恒溫恒濕二氧化碳培養箱中培養的溫度分別設定為33、35、39、41 ℃；對照組細胞在恒溫恒濕二氧化碳培養箱中培養的溫度設定為37 ℃。

1.3.3紅系集落形成單位(CFU-E)集落培養 采用Metho CultTMHCC4230培養基，0.9 mL培養基加入0.1 mL的細胞懸液(細胞密度為每升2×109個)，用IMDM補充為1 mL，充分混勻后轉移至35 mm的6孔培養板，每個標本重復5孔，置不同溫度下培養，飽和濕度的培養箱內，培養4、7、10 d分別計數CFU-E集落，以含50個細胞以上的細胞團為1個集落。

1.3.4流式細胞儀檢測HSCs凋亡率 采用10%胎牛血清的RPMI1640培養基，0.9 mL培養基加入0.1 mL的細胞懸液(細胞密度為每升2×109個)，用IMDM補充為1 mL，將HSCs在不同溫度下分別培養6、12、24 h，使用Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞儀檢測HSCs凋亡率。

1.3.5相關性分析 不同溫度(33、35、37、39、41 ℃)下培養6、12、24 h，研究不同溫度變化和流式細胞儀檢測HSCs凋亡率的相關性分析。

2 結 果

2.1HSCs染色結果 經HE染色，細胞呈扁平狀向外延伸生長，細胞核呈紫藍色，細胞質和細胞外基質呈紅色，見圖1。

圖1 HSCs染色結果(HE，×400)

2.2CFU-E集落分析結果 培養4 d，37 ℃組(對照組)CFU-E集落數最高，33 ℃組和35 ℃組與37 ℃組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；培養7 d，37 ℃組CFU-E集落數最高，33 ℃組、41 ℃組與37 ℃組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；培養10 d，37 ℃組CFU-E集落數最高，33 ℃組與37 ℃組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 CFU-E集落分析個)

注：與37 ℃組比較，*P<0.05

2.3流式細胞儀檢測HSCs凋亡率 培養6 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低，33 ℃組、35 ℃組與37 ℃組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；培養12 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低，35 ℃組、39 ℃組與37 ℃組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；培養24 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低，35 ℃組、41 ℃組與37 ℃組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 流式細胞儀檢測HSCs凋亡率%)

注：與37 ℃組比較，*P<0.05

2.4相關性分析 分別培養6、12、40 h，在不同溫度下流式細胞儀檢測HSCs凋亡率：培養6 h后溫度變化與流式細胞儀檢測HSCs凋亡率具有相關性(r=0.888,P<0.01)；培養12 h后溫度變化與流式細胞儀檢測HSCs凋亡率具有相關性(r=0.795,P<0.01)；培養24 h后溫度變化與流式細胞儀檢測HSCs凋亡率具有相關性(r=0.834,P<0.01)。

3 討 論

HSCs在一定的溫度條件下才能維持生命和代謝，根據細胞周圍環境中溫度的差異，其生物學行為也會隨之表現不同。細胞在人體內生存的平均溫度為37 ℃，因此目前細胞培養大多采用37 ℃作為標準溫度。溫度的變化對細胞的生長和凋亡存在一定的影響，溫度的變化也促成了胚胎發育和多種病變的發展[10-14]。但目前對于HSCs的培養多采用常溫環境，這與其在體內存在的具體環境存在一定的差異，因此采用不同溫度培養HSCs可更加真實地模擬其體內外的生長環境。

作為前體細胞的HSCs最大的特點就是具有高度自我更新、自我修復和多向分化的能力。HSCs的復制、增殖、多向分化、歸巢后重建造血、凋亡等生物功能受到周圍各種環境因素的影響。HSCs主要生存于骨髓區、靜脈血、動脈血中，37 ℃是其生存的平均溫度，人體各個器官和組織的溫度存在差異，在HSCs移植過程中溫度也必然發生變化，溫度的變化也將影響HSCs的各項生物學功能[15]。本研究中將各組溫度設定為33、35、37、39、41 ℃，正是要觀察HSCs在不同溫度下的生長情況，而關于這方面的研究國內外報道較少。

本研究發現HSCs培養4、7、10 d，37 ℃組CFU-E集落數最高；HSCs培養6、12、24 h，33 ℃組HSCs凋亡率最低。由此推測，不同溫度對HSCs的生長和凋亡有影響。37 ℃能促進HSCs的生長，溫度降低可以抑制HSCs的凋亡,為今后的臨床試驗提供了依據。