月季表觀修飾因子DRM3基因沉默載體的構建與作用方式*

韓 凱，董 然，李永紅

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月季表觀修飾因子基因沉默載體的構建與作用方式*

韓 凱1，董 然1，李永紅2*

（1.吉林農業大學，吉林 長春 130118；2.深圳職業技術學院，廣東 深圳 518055）

利用Rose Transcriptome Database獲取月季片段，根據所獲取的目的序列分別設計一對添加了酶切位點的引物-I-F和-I-R，利用反轉錄得到的cDNA為模板進行擴增，得到基因沉默片段，再將酶切的片段連接至T4載體，連接產物轉化大腸桿菌DH5α．酶切和序列分析鑒定表明擴增得到的重組質粒正確，命名為pTRV2-．利用構建好的載體將月季扦插小苗進行病毒誘導的基因沉默（VIGS），獲得沉默植株．其結果為研究低溫影響月季花器官發育的網絡調節提供基礎．

月季；載體構建；病毒誘導的基因沉默；

月季切花的花形是月季觀賞性的基本要素之一[1]，其受損則嚴重影響月季切花品質和商業價值．月季生長發育最宜溫度為18~30℃[3]．有試驗表明，月季切花品種‘Vendela’在25℃/15℃（日/夜）溫度條件下最為適宜，畸形率僅2%，當晝夜溫度分別降低5℃、10℃，畸形率分別升高了34%和86%[2]．冬季低溫可導致月季花器官發育異常，花型畸變，降低月季切花的觀賞品質，導致切花的商業價值降低80%~90%，給花卉生產商帶來巨大的經濟損失[2]．因此，研究低溫調控月季花發育的網絡調節機制是解決低溫導致月季切花品質降低的有效途徑．

根據之前研究建立的月季花蕾初期低溫處理的轉錄數據庫檢索發現，有16個差異表達的基因與表觀修飾相關，因此推測表觀修飾可能在低溫影響花器官發育的過程中發揮著重要的作用．筆者通過對低溫條件下基因表達出現明顯變化，且與表觀修飾相關基因進行基因沉默載體的構建，并利用構建好的載體將月季扦插小苗進行病毒誘導的基因沉默（VIGS），通過PCR檢測，并獲得沉默植株．為今后分析其沉默表型，研究其結合位點和作用方式，以及在低溫影響月季花器官發育過程中的調節網絡提供依據，為解決低溫月季切花生產品質下降這一重要產業問題奠定理論基礎．

1 試驗材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料

‘Vendela’扦插小苗購買于云南某月季培植基地．

1.1.2 菌株與載體

大腸桿菌菌株為DH5α；克隆載體為pMD18-T；VIGS載體為pTRV1、pTRV2質粒；農桿菌菌株為GV3101．

1.1.3 酶類及試劑

TaqDNA聚合酶，限制性內切酶EcoRI、KpnI等，T4DNA連接酶等購自大連寶生物公司，PCR產物和DNA片段回收試劑盒購自百泰克生物公司，核酸分子量標準 marker，MES，AS，MgCl2以及抗生素 Amp、Kan、Rif 等均為國產試劑．

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

應用Primer Premier 5.0軟件設計擴增特異性引物如下：

TRV載體引物：-XbaI-F：5’-GCTCTAG ATTCGTATCCTTGAAGAGCCACC-3’，- KpnI-R：5’- GGGGTACCAAGTCAAAGCCTGGA TCACTGT-3’

半定量引物：-F1：5’-TGAAAGTGTCC GTCGCTAT-3’-R1：5’-TACAAGTTCCCTC CCTGGT-3’

克隆全長引物：-A-F1：5’-CTGATTGTCGTGGAATGCTCTC-3’-A-R1：5’-CTCTGCTCCACCTATTCCAC-3’

公共引物：TRV1-F：5’-TTACA GGTTA TTTGG GCTAG-3’，TRV1-R：5’-CCGGG TTCAA TTCCT TATC-3’TRV2-F：5’-TGGGAGATGATAC GCTGTT-3’TRV2-R5’-CCTAAAACTTCAGACACG-3’

1.2.2基因沉默載體的構建步驟

1）基因的擴增．利用Rose Transcriptome Database 獲取月季片段，根據所獲取的目的序列分別設計一對添了酶切位點的引物-I-F和-I-R（見1.2.1），用反轉錄得到的cDNA為模板進行擴增，得到基因沉默片段．

2）目的DNA片段純化回收．使用DNA純化回收試劑盒（Bio Teke）回收目的片段．

3）酶切反應．選用限制性內切酶R I和I（Takara）對目的片段和載體片段雙酶切，之后液體回收測濃度．

4）連接反應．將酶切的片段連接至T4載體．連接產物轉化大腸桿菌，做菌落PCR檢測，目的條帶送上海生工生物技術公司測序．

5）質粒提取．酶切鑒定正確后提取質粒送交測序．

6）構建pTRV2-沉默載體．

1.2.3 月季扦插苗VIGS

1.2.3.1 農桿菌轉化步驟

槐樹坪金礦床大地構造位置處于華熊臺緣坳陷熊耳山隆起，與秦嶺褶皺系毗鄰，屬華熊臺隆二級構造單元，三級構造單元熊耳山隆起與潭頭—嵩縣新生代斷陷盆地的結合部位(圖1)。地殼具有明顯的地臺型基底和蓋層二元結構，地質構造演化復雜，構造運動強烈，其南西側近EW向發育的潘河—馬超營斷裂，規模大、切割深，是區內重要的控巖控礦構造，而且長期不斷活動，有利于富含礦質的重熔型花崗巖漿及與其生成有關的金、銀多金屬礦產的形成。

1）吸1 μg的質粒（pTRV1，pTRV2-Target and pTRV2-Empty）加入50μL農桿感受態細胞中，吸打混勻，冰浴20min．

2）液氮速凍5 min，37℃水浴熱擊5 min．

3）冰浴5 min加 500 μL LB（無抗性）培養基，28℃搖床培養 6 h．

4）5000 r/min離心5 min，棄去上清，重新懸浮，涂于LB（加Kan和Rif）固體培養基上，28℃培養 2 d．

1.2.3.2 月季扦插苗VIGS侵染步驟

1）配侵染液（1 L）：加 10 mL 1M MES（終濃度 10 mM），4 mL乙酰丁香酮母液（終濃度 200 μM），10 mL 1M MgCl2（終濃度10 mM）．用稀鹽酸調節pH值到5.6，侵染液不用滅菌，現配現用．

2）挑取上述單菌落，每個基因（pTRV1，pTRV2-Target and pTRV2-Empty）型12個單克隆．1.5 mL 離心管加培養基500 μL，28℃，200 r/min，過夜培養菌株，PCR檢測目的基因條帶．

4）將培養好的菌液，稀釋加入到新鮮的100 mL LB培養基中（40 μL AS，100 μL Kan，100 μLRif），28℃過夜培養．PCR檢測有無目的基因條帶．

5）將菌液分裝后離心，收集菌體．

6）用侵染液重懸菌體，使之均勻懸浮．

7）測菌液濃度，使目的基因和空載菌液OD600為2.0．

8）暗處靜置3~6h．

9）將目的基因菌液和 TRV1按1:1混合．

10）將月季苗分別放置于pTRV2-Target和pTRV2-Empty兩個菌液中，使植株完全浸泡．真空抽至0.9 atm后緩慢放氣5 min，抽吸2次．

11）將抽吸后的組培苗反復清洗3次，置于8℃培養箱培養2 d．

11）取出植株，種植于基質中，用保鮮膜覆蓋，放至22℃，相對濕度60%，16 /8 h（光/暗）周期的培養室中培養．15 d左右揭膜，觀察植株生長．

2 結果與分析

2.1 DRM3基因在低溫下的表達

本研究選取了編號為RHL29805，表達差異較大的特異維持CHH甲基化的甲基轉移酶進行研究．

將30株‘Vendela’扦插苗放入22℃培養室生長．40d左右剛剛露出小花蕾時，15株在常溫（22℃）下直接取樣，另外15株低溫（4℃）處理7d后取樣，提取小花蕾RNA后反轉錄，通過RT-PCR檢測分析常溫與低溫條件下基因的表達量．結果顯示與常溫條件相比低溫下表達量升高（圖1），這與低溫轉錄組庫中測定結果一致，證明的表達響應低溫信號．因此推測這個基因很有可能會參與低溫影響月季花器官發育的調控．

2.2 DRM3基因的擴增

利用Rose Transcriptome Database獲取月季片段，根據所獲取的目的序列分別設計一對添加了酶切位點的引物-I-F和-I-R（見1.2.1），用反轉錄得到的cDNA為模板進行擴增，得到基因沉默片段．分析其瓊脂糖凝膠電泳圖（圖2），可以看出有明顯的條帶，即基因擴增成功，可用于構建-載體．

2.3 DRM3沉默載體構建

選用限制性內切酶R I和I（Takara）對目的基因進行雙酶切（圖3），之后液體回收目的片段．然后對載體片段進行酶切，80℃，20min失活酶切產物，-20℃保存（可以直接用于連接）．將酶切好的載體和基因進行連接，再把連接產物轉化大腸桿菌DH5α（圖4），挑出有明顯條帶的7，10，12號送去測序．最終測序與庫中序列比對完全吻合（圖5），最后提取質粒，即沉默載體構建成功．為了沉默月季基因，試驗利用VIGS技術，構建了TRV2-沉默載體（圖6）．

圖1 RT-PCR檢測分析22℃和4℃條件下RHL29805基因的表達

圖2 DRM3基因擴增結果

圖3 雙酶切結果

圖4 菌落PCR結果

圖5 最終序列比對結果

圖6 TRV2-沉默載體

2.4 DRM3在月季‘Vendela’扦插苗中的沉默檢測分析

經過農桿菌侵染的苗，溫室培養50d后，取長出的新葉片提取RNA后，通過RT-PCR對基因表達量進行檢測（圖7），可以看出幾乎沒有明顯條帶，表明基因表達豐度低，獲得了基因沉默植株．

圖7 DRM3在月季‘Vendela’扦插苗中的沉默檢測

3 討 論

低溫是影響花器官發育的重要環境因子之一．研究發現，低溫導致了月季花朵過度重瓣化[4]，一定溫度范圍內溫度越低，花瓣數越多，雄蕊數越少，而且與常溫條件相比表達量顯著降低[2]．這表明表觀修飾在低溫影響花器官發育中發揮著重要的作用．

試驗前期工作已建立了月季花發育初期響應低溫的轉錄數據庫，研究選取了響應低溫的表觀修飾因子基因，即表達差異較大的特異維持CHH甲基化的甲基轉移酶進行研究．RT-PCR檢測常溫和低溫條件下月季初現蕾時基因表達量的變化情況，結果表明：低溫條件下月季花蕾中表達量上調，這與低溫轉錄組庫中測定結果一致，證明響應低溫信號．推測這個基因很有可能會參與低溫影響月季花器官發育的調控．基因在低溫下表達量上調，而催化非對稱位點CHH位點甲基化，當基因沉默之后，植株DNA胞嘧啶的非對稱位點甲基化降低[5]，低溫條件下，沉默植株表達量上升．推測，月季花器官數量受CHH位點甲基化程度的影響．

基因沉默是近幾年發展起來的一項研究生物基因組功能的新技術，病毒誘導的基因沉默技術（VIGS）已經成為研究植物基因組功能的重要工具[6]．目前，TRV病毒載體已在番茄（Solanum lycopersicum）、煙草（Nicotina spp.）、矮牽牛（Petunia hybrida）、辣椒（Capsicum spp.）、擬南芥和棉花（Gossypium spp.）等多種植物上被廣泛應用[7]．該技術研究周期短，不需要遺傳轉化，具有高通量、低成本等優勢[8]，在很大限度的客服了傳統方法的局限性．在基因載體構建中，根據所獲取的目的序列分別設計一對添了酶切位點的引物-I-F和-I-R．最終用反轉錄得到的cDNA為模板進行擴增，得到基因沉默片段，進而成功構建了基因沉默載體．將構建好的沉默載體轉化農桿菌，挑取單菌落，PCR檢測，在侵染液中經過真空抽吸，最終得到基因沉默植株，但是，基因沉默植株其表型如何，以及相關基因間是如何調控其花器官發育等問題還需后續進一步研究．

[1] Dubois A, Raymond O, Maene M, et al. Tinkering with the C-function: a molecular frame for theselection of double flowers in cultivated[J]., 2010，5（2）：e9288．

[2] 范天剛．月季花器官發育基因對低溫導致花朵過度重瓣化的作用究[D]．河北：河北農業大學，2014．

[3] Zieslin N. Regulationof flower formation inplants: a reappraisal[J]., 1992，49（3）：305-310．

[4] Moe R. Factors affecting flower abortion and malformation in[J]., 1971，24（2）：291-300．

[5] Cao XF, Aufsatz W, Zilberman D, et al. Role of the DRM and CMT3methyltransferases inRNA-directed DNA methylation[J]., 2003，13（24）：2212-2217．

[6] 陶小榮，周雪平，崔曉峰，等．病毒誘導的基因沉默及其在植物基因功能研究中的應用[J]．生物化學與生物物理進展，2004（9）：777-783．

[7] 黃昌軍，錢亞娟，李正，等．病毒誘導的基因沉默及其在植物功能基因組研究中的應用[J]．中國科學：生命科學，2012（1）：3-15．

[8] 宋震，李中安，周勇常．病毒誘導的基因沉默（VIGS）研究進展[J]．園藝學報，2014，9（1）：56-61．

The Construction and Action of the Gene Silencing Vector of the EpigeneticModifierGenes

HAN Kai1, DONG Ran1, LI Yonghong2*

（）

Using Rose Transcriptome Database to get Chinese Rosefragments, a pair of primers added enzyme lociXbaI - F and DRM3 KpnI - R is designed respectively based on the sequence of purpose. A reverse transcription of cDNA as a template for amplification is used to acquirefragment gene silencing. Then enzyme fragment is connected to the T4 carrier and connecting product is turned intoDH5a. Enzyme digestion and sequence analysis shows that the amplified recombinant plasmid is correct and hence named pTRV2-. The virus-induced gene silencing (VIGS) is carried out by using the constructed vector to cut the seedlings in the Chinese rose and get the silencing plant ofgene. The result provides a theoretical basis for studying the regulating network of flower organ development under low temperature.

rose; vector construction; virus-induced gene silencing;

10.13899/j.cnki.szptxb.2018.05.008

2018-05-20

國家自然科學基金資助項目（601523K27028）

韓凱（1992-），男，甘肅定西市人，碩士，研究方向：園林植物逆境生理．

李永紅（1971-），男，湖南岳陽人，博士，教授，研究方向：園林植物花朵發育分子生物學（E-mail：liyongh@szpt.edu.cn）．

Q943.2

A

1672-0318（2018）05-0047-05