一測多評法測定藜麥中6種酚類成分

魏麗娟,易 倩,張 曲,趙 鋼,彭鐮心,*

(1.成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院,四川成都 610106; 2.成都大學(xué)農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610106)

藜麥(Chenopodiumquinoawilld)屬藜科雙子葉植物,是一種新興的世界作物。藜麥雖然原產(chǎn)于玻利維亞、智利和秘魯?shù)饶厦绹?但自上世紀(jì)末在中國西藏開始種植以來,藜麥的營養(yǎng)研究與價(jià)值挖掘在中國得到了迅速發(fā)展,從2008年便開始在中國山西大面積種植,隨后在四川、內(nèi)蒙古、云南、甘肅等地種植[1]。藜麥營養(yǎng)豐富,含有約16%的蛋白質(zhì)和70%的淀粉[2-4],高于水稻和玉米,和小麥相當(dāng),礦物質(zhì)、纖維素、維生素等含量均高于普通的食物,含有人體所需的全部必需氨基酸,與人類生命活動(dòng)的基本物質(zhì)需求完美匹配;同時(shí),藜麥還含有多酚、黃酮、多糖、皂苷等生物活性物質(zhì),具有抗氧化、抗炎、降血糖、減肥等生理活性[5-7],是聯(lián)合國糧農(nóng)組織確認(rèn)的唯一一種滿足人體基本營養(yǎng)需求的單體植物,被譽(yù)為“超級谷物”[8],具有提高人群營養(yǎng)水平和預(yù)防多種疾病發(fā)生的潛在功效[9]。

酚類成分廣泛存在于各種雜糧、水果、蔬菜、茶中,具有廣泛的生理活性,能與維生素C、維生素E和胡蘿卜素等其他抗氧化物在體內(nèi)一起發(fā)揮抗氧化功效,在人體飲食營養(yǎng)健康中具有重要地位[10-12]。文獻(xiàn)表明,藜麥中主要含有咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素等多種酚類成分[13-14],可作為藜麥質(zhì)量控制指標(biāo)。藜麥中的酚類成分往往具有協(xié)同作用,因此需對其含量進(jìn)行全面控制,才能更好保障藜麥的品質(zhì)。然而,由于對照品來源限制,目前藜麥中酚類成分的測定大多采用傳統(tǒng)的外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法控制其中的某個(gè)成分,難以保證其質(zhì)量[15-18]。一測多評法通過計(jì)算待測成分間校正因子,可實(shí)現(xiàn)在只有一種對照品的情況下同時(shí)測定多種成分,已廣泛應(yīng)用于中藥材質(zhì)量評價(jià)中[19-22];結(jié)合超高效液相色譜的高效分離能力,可實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確快速的測定藜麥中的酚類成分,為藜麥的質(zhì)量評價(jià)提供新的方法。

本課題組前期研究表明,異葒草素是藜麥酚類成分中含量較高、并且保留時(shí)間居中的一種酚類成分[23-24]。有研究表明,異葒草素有抗氧化的作用,主要是通過清除DPPH自由基;同時(shí)具有抗炎的作用;除此之外,異葒草素還具有保護(hù)臟器,刺激胰島素分泌、治療糖尿病的效果;能夠使腫瘤細(xì)胞活性下降;弱化肝纖維化;抑制肝癌細(xì)胞增值;還具抗病毒[25-27]等其他多種功能。因此本實(shí)驗(yàn)以5種藜麥為研究對象,選擇異葒草素作為參照,即只測定異葒草素這一個(gè)成分,通過確定它與咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素間的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系,通過外標(biāo)法和一測多評法得到5種藜麥中各酚類成分的含量值,驗(yàn)證一測多評法在藜麥的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價(jià)中的適用性,進(jìn)而建立藜麥中酚類成分質(zhì)量控制的方法,為藜麥中酚類成分的測定提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藜麥-1、隴藜1號、隴藜2號、隴藜3號、隴藜4號 農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(成都大學(xué)),產(chǎn)地為四川省涼山州鹽源縣,采收期為2017年8月;咖啡酸對照品(批號:16081501)、對香豆酸(批號:16061805)、阿魏酸對照品(批號:17022303)、異葒草素對照品(批號:16080404)、蘆丁對照品(批號:16031602)、槲皮素對照品(批號:16063005) 純度均大于98%,四川省維克生物科技有限公司;甲醇 色譜純,安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?冰乙酸 色譜純,成都市科龍化工試劑廠;水 重蒸餾水;其余試劑 均為分析純。

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色譜儀(QSM四元泵、SM-FTN進(jìn)樣器、CH-A柱溫箱、PDA檢測器) 沃特世上海科技有限公司;KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;CP224C十萬分之一電子分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司;H2050R高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品的制備 精密稱定對照品咖啡酸0.00970 g、對香豆酸0.01004 g、阿魏酸0.00988 g、異葒草素0.00891 g、蘆丁0.00826 g、槲皮素0.00602 g分別置于10 mL棕色容量瓶中,加甲醇溶解并定容至10 mL,制成對照品儲(chǔ)備液。分別取對照品儲(chǔ)備液適量置于10 mL棕色容量瓶,加甲醇定容至10 mL,制成含咖啡酸19.40 μg/mL、對香豆酸50.20 μg/mL、阿魏酸49.40 μg/mL、異葒草素44.55 μg/mL、蘆丁41.80 μg/mL、槲皮素60.20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液,于4 ℃保存,備用。

1.2.2 藜麥中酚類物質(zhì)的提取 酚類物質(zhì)的提取參考課題組前期對酚類成分的提取方法做適當(dāng)調(diào)整[23],即取60 ℃烘干至恒重的藜麥粉(過60目篩),精密稱定約1.00 g,置于100 mL錐形瓶中,加70%甲醇水溶液25 mL,搖勻并稱重,60 ℃超聲處理30 min,取出冷卻至室溫,用70%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量,搖勻,12000 r/min離心15 min,取上清液,0.22 μm微孔濾膜過濾,取過濾液,待測。

1.2.3 酚類測定色譜條件 ACQUITYUPLC?BEHC18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm)色譜柱;流動(dòng)相:甲醇(A)-0.2%冰乙酸水溶液(B);梯度洗脫(洗脫程序見表1);檢測波長為247 nm;柱溫為35 ℃;流速為0.2 mL/min;進(jìn)樣量1 μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution sequence

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 線性關(guān)系考查 分別精密吸取1.2.1對照品溶液適量,置于10 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,搖勻配成不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,按1.2.3色譜條件測定,每個(gè)濃度分別進(jìn)樣3次,取平均值,以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積積分值為縱坐標(biāo)(Y),繪制咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,得到各成分的回歸方程及線性范圍。

1.2.4.2 待測成分的fs/x的計(jì)算 在線性范圍內(nèi)各成分的量與響應(yīng)信號峰面積呈正比增減,即f=W/A,f表示校正因子,W表示成分的量,A表示儀器響應(yīng)值。在對藜麥中6種酚類成分進(jìn)行質(zhì)量控制時(shí),以異葒草素(s)為內(nèi)參物,根據(jù)公式fs/x=fs/fx=AxCs/(AsCx)(式中,Cs、Cx分別代表內(nèi)參物與待測物成分質(zhì)量濃度,As、Ax分別代表內(nèi)參物與待測成分的儀器響應(yīng)值),計(jì)算異葒草素與咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素之間的fs/x。再通過fs/x方法計(jì)算咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素5種成分的量。即取1.2.1的不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液,按1.2.3色譜條件測定,測定咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積,以異葒草素為內(nèi)標(biāo)物,分別計(jì)算各待測成分與異葒草素之間的fs/x。

1.2.4.3 精密度考查 取咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素對照品適量,按1.2.1混合標(biāo)準(zhǔn)品的制備方法制備混標(biāo),按1.2.3色譜條件測定,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,以峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.4.4 重復(fù)性考查 取藜麥粉末樣品(過60目篩)6份,按1.2.2樣品溶液的制備方法制備藜麥提取液,按1.2.3色譜條件測定,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,以峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.4.5 穩(wěn)定性考查 取藜麥粉末樣品,按1.2.2樣品溶液的制備方法,制備藜麥提取液,精密吸取同一樣品溶液,分別在0、4、6、8、12、24 h進(jìn)樣1 μL,按1.2.3色譜條件測定,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,按峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.4.6 保留時(shí)間的考查 取藜麥粉末樣品(過60目篩)6份,按1.2.2樣品溶液的制備方法制備樣品溶液溶液,按1.2.3色譜條件測定,記錄咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的峰面積積分值,以峰面積分別計(jì)算RSD值。

1.2.4.7 加樣回收率考查 取已知含量藜麥樣品粉末,精密稱取樣品約1.00 g,精密稱定,共6份,分別加入咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素對照品適量,按1.2.2樣品溶液的制備方法制備藜麥提取液,按1.2.3色譜條件測定。計(jì)算咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的平均加樣回收率和RSD值。

1.2.5 樣品測定及一測多評法的驗(yàn)證 取各個(gè)品種的藜麥粉末各約1.00 g,精密稱定,按1.2.2方法制備藜麥提取液,采用外標(biāo)法按1.2.3測定5種不同品種藜麥中6種成分含量。再按照建立的一測多評法對待測成分進(jìn)行色譜峰的定位,以異葒草素為內(nèi)標(biāo),計(jì)算其余待測成分含量,并采用SPSS軟件對兩種方法測得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 對照品和樣品色譜圖

預(yù)實(shí)驗(yàn)對不同流動(dòng)相、不同流速、不同波長、不同溫度等條件進(jìn)行研究,結(jié)果表明最適檢測條件如下:甲醇(A)-0.2%冰乙酸(B)為流動(dòng)相,流速為0.2 mL/min,檢測波長為247 nm,柱溫為35 ℃,色譜條件經(jīng)優(yōu)化后,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素分離良好,出峰時(shí)間分別為4.473、5.963、6.731、7.221、9.259、14.345 min。樣品與對照品色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液色譜圖(A)和樣品對照色譜圖(B)Fig.1 UPLC chromatograms of mixed standard solution(A)and control sample(B)注:1.咖啡酸;2.對香豆酸;3.阿魏酸; 4.異葒草素;5.蘆丁;6.槲皮素。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 通過線性回歸分析,得到各成分的回歸方程式和線性范圍,如表2。結(jié)果表明,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素分別在0.776～19.400、1.004～50.200、0.988～49.400、0.891～44.550、0.836～41.800、3.010～60.200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 藜麥中6種酚類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of six polyphenols components in quinoa

2.2.2 相對校正因子 由表3可知,各相對校正因子的RSD值分別為1.60%、1.56%、1.21%、1.17%、2.95%,均小于3%。經(jīng)分析和綜合比較影響相對校正因子的因素,取各質(zhì)量濃度下獲得的相對較正因子(fs/x)的平均值,最終確定咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素與的異葒草素的fs/x分別為1.73、0.32、1.15、0.76、0.56。

表3 5種酚類成分與異葒草素的相對校正因子Table 3 Relative correction factors of isoorientin/five polyphenols components

2.2.3 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與回收率 咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、蘆丁、槲皮素的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、相對保留時(shí)間、加樣回收率的RSD值均小于2%,由此可知儀器的精密度良好,藜麥酚類成分重復(fù)性良好,在24 h內(nèi)穩(wěn)定;回收率在95%～105%之間,說明該提取方法準(zhǔn)確可靠。

表4 精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性與回收率考查結(jié)果Table 4 Investigation results of precision,stability,reproducibility and recovery

2.3 一測多評法的驗(yàn)證

為了確認(rèn)一測多評法的準(zhǔn)確性,用外標(biāo)法進(jìn)行比較。兩種方法得到的含量值之間用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行比較,相關(guān)系數(shù)皆為1.0000,說明兩種方法得到的各物質(zhì)含量的相似性極高;從一測多評法和外標(biāo)法含量間的相對誤差來分析,咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素分別為2.17%、2.79%、1.10%、0.96%、2.3%,亦在3%以內(nèi);ESM實(shí)際測定含量與本實(shí)驗(yàn)所建立的QAMS計(jì)算所得含量,經(jīng)配對t檢驗(yàn)結(jié)果顯示,兩種方法所得含量值無顯著性差異(p>0.05),說明本實(shí)驗(yàn)建立的一測多評法具有較好的準(zhǔn)確性和可行性,在藜麥的多指標(biāo)成分質(zhì)量評價(jià)中應(yīng)用是可行的。

由表5可知,5個(gè)藜麥品種之間異葒草素、咖啡酸、蘆丁的含量均存在顯著性差異(p<0.05);藜麥-1、隴藜3號、隴藜4號三個(gè)品種之間的對香豆酸沒有顯著性差異(p>0.05),但是分別和其他兩個(gè)品種之間存在顯著性差異(p<0.05);隴藜3號和隴藜4號之間的阿魏酸和槲皮素沒有顯著性差異(p>0.05),但是分別和其他三個(gè)品種之間存在顯著性差異(p<0.05);5個(gè)品種中,隴藜1號含有最高的異葒草素,含量為370.61 μg/g;隴藜2號含有最高的咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸及槲皮素,含量分別為8.04、300.21、17.75、42.75 μg/g;隴藜-1含有最高的蘆丁,含量為35.56 μg/g。此結(jié)果也說明,藜麥中酚類成分含量受自身遺傳因素的影響,本結(jié)果可為藜麥的選育提供參考。

表5 藜麥中6種酚類成分一測多評法(QAMS)與標(biāo)準(zhǔn)曲線法(ESM)測定結(jié)果比較(μg/g)Table 5 Comparison of the determination results of six polyphenols components in quinoa by QAMS and standard curve method

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了藜麥中6種酚類成分的一測多評檢測方法,考察了重復(fù)性、穩(wěn)定性、精密度、回收率以及保留時(shí)間的重復(fù)性,結(jié)果為RSD值均小于2%,回收率在95%～105%之間,表明藜麥中6種酚類成分的分離良好、組分色譜峰峰形對稱、保留時(shí)間穩(wěn)定,儀器精密度良好,方法學(xué)考察表明本文所建立方法準(zhǔn)確可靠。并且本實(shí)驗(yàn)對5種藜麥中6種酚類成分的一測多評法計(jì)算值和外標(biāo)法測定值的測定結(jié)果利用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果為一測多評法計(jì)算值與外標(biāo)法測定值得到的含量值之間沒有顯著性差異(p>0.05);通過對5個(gè)藜麥品種之間6種酚類物質(zhì)含量的分析,可知不同的品種之間,6種酚類物質(zhì)存在差異,其中隴藜2號中含有較高的咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸及槲皮素,本結(jié)果可為藜麥的選育提供參考。本實(shí)驗(yàn)建立的一測多評法可以在只有異葒草素而無其他對照品的情況下,通過QAMS實(shí)現(xiàn)藜麥中其他5種酚類成分的定量,方法準(zhǔn)確可行,結(jié)果可靠,可用于對藜麥中的酚類成分進(jìn)行定量。