大黃中抗氧化物質的提取工藝優化

袁詩俊,龔夢瑀,李夢林,順遠楓,黃 毅

(西南科技大學生命科學與工程學院,四川綿陽 621010)

自由基是單質或化合物均裂產生的帶有未成對電子的原子或基團,研究表明其與多種疾病的發生有密切的關系[1]，能夠有效抑制自由基的產生有助于有效地預防,延緩甚至治愈,如阿爾茲海默病[2]、慢性支氣管炎[3]和青光眼[4]等疾病。因此,近年來,抗氧化物質,特別是天然產物來源的抗氧化物質的開發成為研究熱點。大量的化妝品中添加植物抗氧化劑,對抗自由基引起的皮膚衰老[5]。很多天然食品或藥品如葡萄、虎杖和桑椹中的白藜蘆醇等早已作為膳食補充劑,用于保健及疾病預防[6]。

大黃(Rhubarb)是蓼科大黃屬植物的干燥根莖,為我國常用中藥材，其臨床應用廣泛,具有顯著止瀉、抗腫瘤和腦保護等效果。近年來,大黃抗氧化作用也受到了廣泛關注,其所含大黃酸[7]、大黃素[8]等蒽醌類衍生物以及鞣質等能直接對抗自由基損傷細胞的效果,有利于機體機能修復及細胞的抗衰老,對于其他藥用功效也有較強的輔助效果。

本課題組在對傳統中藥材抗氧化能力的初步篩選系列工作中,發現大黃具有非常強的抑制自由基活性。現有文獻對其抗氧化活性的物質基礎并不完全清晰,提取方面的報道更是著重某一化學類別物質的工藝優化而非以活性為檢測指標,如蒽醌類[9]或多糖類[10]等。為了促進大黃作為天然抗氧化保健藥食品的開發以及其抗氧化活性物質的后續分離工作,本文采用正交試驗對大黃抗氧化活性物質的提取工藝進行研究,優化提取方案。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大黃(產地青海,批號 160901)藥材飲片 于2017年購自四川綿陽桐君閣大藥房,經鑒定為蓼科大黃屬植物藥用大黃(RheumofficinaleBaill)的干燥根莖,藥材經60 ℃烘干,粉碎過50目篩,4 ℃避光干燥保存備用,整個提取工藝優化實驗在1月內完成;DPPH(1,1-二苯-2-苦肼自由基) 梯希愛(上海)化成工業發展有限公司;無水乙醇 成都市科龍化工試劑廠;以上試劑 均為分析純；純水 為實驗室自制(電阻率為18 MΩ·cm)。

7200型可見光分光光度計 龍尼柯(上海)儀器有限公司;小型中藥材粉碎機 上海淀久中藥機械廠;XH-C型渦旋混合器 金壇市天竟實驗儀器廠;D1008E型小型離心機 美國Scilogex有限公司;KQ-200KDE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;BSA124S型電子天平 德國賽多利斯有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大黃中抗氧化物質的提取 采用超聲輔助提取(功率恒定為200 W),準確稱取500 mg大黃藥材粉末于具塞錐形瓶中,加入10 mL無水乙醇,封口并記錄瓶重,超聲提取10 min后,按記錄重量補足溶劑,將提取液于10000 r/min離心1 min,取上清液用于抗氧化活性檢測。

1.2.2 單因素實驗 影響提取效果的因素主要包括乙醇濃度,浸提溫度,提取時間和固液比,通過預實驗發現浸提溫度對提取物抗氧化活性影響不大,因此選取剩余三因素進行單因素實驗。以DPPH自由基的清除率作為考察指標,固定提取時間為10 min,固液比為1∶10條件下考察了乙醇濃度100%、80%、60%、40%和20%對抗氧化物質提取的影響;固定乙醇濃度為100%,固液比為1∶10,考察浸提時間10、30、50、70和90 min對抗氧化物質的提取影響;固定乙醇濃度100%,浸提時間10 min,考察固液比為1∶90、1∶70、1∶50、1∶30、1∶10對大黃中抗氧化活性物質提取的影響。為保證固液比測定的準確性,不同固液比提取的最終溶液均稀釋到相同濃度進行抗氧化活性比較。

1.2.3 正交試驗 參考報道[11]文獻,在各單因素實驗的自由基清除率極大值附近選取三個水平,以DPPH自由基清除率為指標,設計3因素3水平正交表L9(34)進行正交試驗,優化大黃中抗氧化活性成分的提取工藝。

表1 L9(34)正交實驗因素與水平Table 1 Factors and levels in the L9(34)orthogonal test

1.2.4 DPPH抗氧化活性檢測 抗氧化活性測定包括DPPH法、羥基自由基、超氧陰離子自由基、總還原力和鐵螯合能力測定等多種方法,在預實驗中筆者發現以上方法結果具有一致性。為方便工藝研發中活性的快速跟蹤,本實驗選用了較為簡便的DPPH自由基清除率實驗來進行抗氧化活性判定。采用Pyrzynska等[12]報道的方法略作修改,準確移取200 μL樣品溶液與4 mL DPPH溶液(30μg/mL,由無水乙醇配制,該溶液在517 nm處吸光度值約為0.8)于試管中,渦旋混勻后避光5 min,10000 r/min離心1 min,取上清液轉入比色皿,室溫下測定517 nm處吸收值。該值伴隨自由基清除劑量的增多而減弱,樣品抗氧化能力可用清除率(Scavenging rate,簡寫為SR%)來表示,計算公式如下:

SR(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為0.2 mL測試溶液與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值;Aj為0.2 mL測試溶液與4 mL無水乙醇溶劑混合后的吸光度值;A0為0.2 mL制備測試溶液時所用溶劑與4 mL DPPH溶液混合后的吸光度值。

1.3 數據處理

所有實驗平行測定3次,單因素實驗結果用平均值±SE表示,正交實驗結果用平均值表示,采用SPSS 20.0軟件進行ANOVA分析(顯著性水平p<0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度 由圖1可知,乙醇濃度小于60%時,自由基清除率緩慢提高。伴隨乙醇濃度的繼續上升,清除率大幅下降。可推斷大黃中抗氧化活性物質主要為親水性化合物,其更易溶于水而非乙醇。在后續正交試驗中乙醇濃度這一因素選擇40%、60%和80% 這3個水平進行正交試驗。

圖1 乙醇濃度對清除率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on clearance rate

2.1.2 提取時間 由圖2可知,提取時間對抗氧化活性的影響呈鐘形分布。提取開始后,伴隨時間延長,溶劑充分浸透大黃粉末,促進了顆粒中抗氧化物質的充分溶出,使得清除率增加,抗氧化活性升高，到30 min時清除率基本達到最大值,此后,自由基清除率反而伴隨時間延長而下降,原因可能是超聲時間過久,超聲波的空化效應和熱效應都會破壞抗氧化活性物質的結構[13]。后續正交試驗中提取時間選取10、30和50 min 3個水平進行正交試驗。

圖2 提取時間對清除率的影響Fig.2 Effect of extraction time on clearance rate

2.1.3 固液比 由圖3可知,固液比在1∶10～1∶30(即樣品濃度大于33 mg·L-1)時,DPPH的清除率隨著溶劑占比的增加而增大,說明伴隨溶劑量的增加,樣品中抗氧化活性物質與溶劑接觸面積增加,使得更多的抗氧化活性物質有效溶出，但當固液比達到1∶30并繼續增加溶劑量時,提取液對DPPH自由基的清除率并未繼續上升而是基本保持恒定狀態。鑒于溶劑用量過大會造成成本上升,因此選取1∶10、1∶30和1∶50這3個水平進行正交試驗。

圖3 固液比對清除率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on clearance rate

2.2 正交實驗及驗證

正交試驗結果及分析見表2和表3,極差R值反應出,影響大黃提取物的抗氧化活性的因素由主到次依次為A時間>B乙醇濃度>C固液比。A因素第2水平的均值最大,故因素A的優選水平為2,同理因素B和C的優選水平均為2。所以本實驗的最佳工藝條件為A2B2C2,即提取時間為30 min,乙醇濃度為60%,固液比為1∶30。

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Orthogonal test results and range analysis

表3 方差分析表Table 3 Variance analysisTable

根據以上最優條件:提取時間30 min,乙醇濃度60%和固液比為1∶30進行最優工藝驗證,3組平行實驗得到的結果為96.02%±1.36%,該結果符合預期且優于以上所有水平表現,表明該優化參數可行。

3 結論

由于抗氧化活性物質種類多樣,已報道的工藝開發方法雖然明確了化合物類別,但提取時容易遺漏具有抗氧化活性的其他類成分。本研究以生物活性為指標進行工藝優化避免了以上問題的出現。最終,通過單因素和正交試驗,以提取物對自由基的清除率為指標,得到大黃抗氧化活性物質的最佳提取條件為提取時間30 min、乙醇濃度60%和固液比為1∶30,此時其自由基清除率可達96.02%±1.36%,該工藝可為大黃作為保健藥食品的開發利用提供一定的理論和應用依據。