培養基成分對酸土脂環酸芽孢桿菌生長 及芽孢形成的影響

馮 鑫,何承云,徐茜茜,焦凌霞

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

酸土脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)主要存在于土壤及水果加工產品中,具有在低pH和高溫條件下生存的能力,可導致酸性果汁在貨架期發生腐敗變質,使產品具有藥味和腐敗味等異味[1-2]。1998年的美國食品加工商協會(NFPA)報告顯示,35%的果汁污染與嗜酸芽孢桿菌有關,而引起酸性果汁腐敗的嗜酸芽孢桿菌主要是酸土脂環酸芽孢桿菌。該菌屬最早在巴氏滅菌蘋果汁中發現[3],隨后相繼在橙汁、番茄汁、菠蘿汁、西番蓮汁、葡萄汁、芒果汁及罐裝番茄丁等產品中檢出酸土脂環酸芽孢桿菌[4-6]。目前,由酸土脂環酸芽孢桿菌引起的腐敗，給果汁加工業造成了巨大的經濟損失。研究認為，控制酸土脂環酸芽孢桿菌污染，是防止酸性飲料變質的關鍵,國際出口貿易中嚴格要求，每10 mL濃縮果汁中，該菌的含量不大于一個[7],因此，酸土脂環酸芽孢桿菌的危害控制，已成為果汁產業普遍關注的問題。

酸土脂環酸芽孢桿菌是耐酸、耐熱、好氧型、革蘭氏陽性芽孢桿菌,呈桿狀或短桿狀,生長pH范圍為2.5～6.0,生長溫度范圍為25～60 ℃,在不利于營養菌體生長的條件下形成中生芽孢、近端芽孢或終端橢圓形芽孢[8],該菌芽孢具有更強的耐高溫高酸特性,其芽孢經傳統的巴氏殺菌(92 ℃,10 s)處理仍能夠存活,在蘋果汁中的D值范圍為D90 ℃=11.1 min至D100 ℃=0.7 min[9],對果汁工業的滅菌工藝提出了嚴峻的挑戰。休眠中的芽孢對外界環境非常敏感,一旦受到外源營養物(L-氨基酸、嘌呤氨基酸、AGFK)或非營養物(溶菌酶、鹽、高壓、Ca2+-DPA、表面活性劑)等刺激，即可啟動萌發,恢復到一個活躍的營養菌體形式[10-11]。存在于果汁中的酸土脂環酸芽孢桿菌，其芽孢在適宜環境下就會迅速啟動萌發，進而生長繁殖,導致果汁腐敗變質[12]。芽孢是細菌生長的特定階段,它的形成與菌種有關,不同菌種的芽孢形成條件不同,同時還受到營養物質及環境因素的影響[13]。本論文通過單因素和雙因素交互試驗，研究碳源、氮源及多種無機鹽對酸土脂環酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成的影響,旨在探索影響該菌芽孢形成的因素及形成規律,為控制該菌芽孢污染及酸性水果產品保藏提供實驗和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酸土脂環酸芽孢桿菌(AlicyclobacillusacidoterrestrisDSM 3922T) 德國菌種保藏中心;葡萄糖、硫酸鎂、氯化鈣、磷酸二氫鉀、硫酸錳、硫酸銨 均為分析純,天津市德恩化學試劑有限公司;酵母提取物、蛋白胨 北京奧博星生物技術有限責任公司。

Quanta 200環境掃描電子顯微鏡 美國FEI公司;Varioskan Rash多功能酶標儀 美國賽默飛世爾科技公司;HV85全自動高壓滅菌鍋 平山制作所株式會社(HIRAYAMA);SW-CJ-IF型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;DNP-9052型電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;ZQTY-70F型振蕩培養箱 上海知楚儀器。

1.2 培養基的制備

Alicyclobacillusacidoterrestrismedium(AAM)液體培養基:葡萄糖2.0 g,酵母浸粉2.0 g,MgSO4·7H2O 1.0 g,CaCl2·2H2O 0.5 g,KH2PO41.2 g,MnSO4·4H2O 0.5 g,(NH4)2SO40.4 g,無菌水定容至1 L,調節pH為4.0,作為芽孢形成試驗的基礎培養基;

計數培養基(SK固體培養基[14]):酵母浸粉2.5 g,蛋白胨5.0 g,葡萄糖1.0 g,CaCl20.25 g,瓊脂15 g,無菌水定容至1 L,調節pH為4.0,菌落計數用。

1.3 實驗方法

1.3.1 酸土脂環酸芽孢桿菌生長曲線及芽孢形成曲線測定 挑取平板上酸土脂環酸芽孢桿菌單菌落,接種到AAM液體培養基中,45 ℃,250 r/min振蕩培養6 h活化菌種,經活化后的菌懸液中活菌數約達108cfu/mL。將此菌懸液按1%的接種量轉接到100 mL AAM液體培養基中(500 mL三角瓶),45 ℃,250 r/min振蕩培養24 h。每2 h取出3 mL菌液,采用稀釋涂布平板法，測定菌體總數和芽孢數[15]。其中1 mL菌液進行梯度稀釋后涂布平板,測得的菌落總數即為菌體總數;1 mL菌液置于80 ℃水浴中處理20 min,除去酸土脂環酸芽孢桿菌營養菌體后，再進行梯度稀釋,然后涂布平板,測得菌落總數即為芽孢數;另外1 mL菌懸液于5000×g條件下離心10 min，收集菌體,用來進行菌體形態的掃描電鏡觀察。芽孢數與菌體總數的比值即為芽孢形成率(芽孢形成率=芽孢數/菌體總數×100)。以培養時間為橫坐標,菌體總數和芽孢數的對數值為縱坐標,制作菌體生長曲線和芽孢形成曲線。

1.3.2 菌體形態的掃描電鏡觀察 將1.3.1中離心收集的菌體用預冷的無菌超純水反復清洗5次,置于含有2.5%的戊二醛(C5H8O2)溶液中，進行菌體形態的固定,4 ℃固定2 h備用。將固定好的樣品用無菌超純水清洗1次,再用乙醇梯度脫水(35%、50%、70%、80%、90%、100%)1～2次,每次脫水10～15 min。將脫過水的樣品浸泡在乙酸異戊酯(C7H14O2)與乙醇1∶1的混合液中15～20 min,再置于乙酸異戊酯中浸泡20 min并溫和振搖,自然風干后，利用掃描電鏡觀察菌體的形態變化。

1.3.3 營養因子單因素水平設置 以AAM液體培養基中各種營養因子的添加量為固定水平,分別進行梯度遞減和增加,共設置5個水平。取活化后的菌液,按1%的接種量，分別接入含有不同濃度營養因子的50 mL培養基(250 mL三角瓶)中,45 ℃,250 r/min振蕩培養24 h,按照1.3.1所述方法取樣，檢測菌體總數和芽孢數,每個處理設3個重復。進行單因素試驗。

碳源:以葡萄糖作為唯一碳源,濃度設定為0、1、2、3、4 g/L。

氮源:以酵母浸粉作為有機氮源,(NH4)2SO4作為無機氮源。酵母浸粉的濃度設定為0、1、2、3、4 g/L;(NH4)2SO4的濃度設定為0、0.2、0.4、0.6、0.8 g/L。

無機鹽:本實驗中的無機鹽包括CaCl2、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4。CaCl2的濃度設定為:0、0.19、0.38、0.57、0.76 g/L;MnSO4·H2O的濃度設定為:0、0.19、0.38、0.57、0.76 g/L;MgSO4·7H2O的濃度設定為:0、0.5、1、1.5、2.0 g/L;KH2PO4的濃度設定為:0、0.6、1.2、1.8、2.4 g/L。

1.3.4 營養因子雙因素試驗 根據單因素實驗結果,設計雙因素實驗(表1)，觀察不顯著因素的交互作用對酸土脂環酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成的影響。

表1 三種非顯著營養因子缺陷的培養基Table 1 The mediums of defecting three kinds of non-significant nutritional factors

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 酸土脂環酸芽孢桿菌生長及芽孢形成

酸土脂環酸芽孢桿菌在45 ℃條件下生長狀況良好,培養2 h后進入對數生長初期,培養6～8 h為對數中期,12 h進入穩定期(圖1)。一些營養菌體在培養8 h時，出現頂端膨脹,10 h時，大多數菌體進入芽孢形成階段,18 h時，菌體幾乎全部形成芽孢(圖2)。

圖1 酸土脂環酸芽孢桿菌DSM 3922T 在45 ℃條件下的生長和芽孢形成曲線Fig.1 Growth and spore formation curve of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T at 45 ℃

圖2 酸土脂環酸芽孢桿菌DSM 3922T在45 ℃條件下培養不同時間的菌體形態Fig.2 Microbial morphology of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922Tat 45 ℃ for varying durations注:A:6 h,B:8 h,C:10 h,D:18 h。

2.2 碳源對酸土脂環酸芽孢桿菌生長及芽孢形成的影響

由圖3可知,當培養液中不含葡萄糖時,45 ℃,250 r/min振蕩培養24 h,菌體總數為7.06 lg cfu/mL,芽孢數為6.92 lg cfu/mL,芽孢形成率為73.2%。隨著培養基中葡萄糖濃度的提高,菌體總數和芽孢數均有所增加。當葡萄糖濃度增加到2 g/L時,菌體總數達到7.66 lg cfu/mL,芽孢數達到7.64 lg cfu/mL,芽孢形成率達到97.8%,較對照組提高了24.6%。繼續提高葡萄糖濃度,菌體總數和芽孢數均無明顯增加。方差分析結果表明，葡萄糖對酸土脂環酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成影響顯著(p<0.05)。

圖3 葡萄糖濃度對酸土脂環酸芽孢桿菌 DSM 3922T菌體總數和芽孢數的影響Fig.3 Effects of glucose concentrations on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T注:不同小寫字母表示同一指標間 差異顯著(p<0.05),圖4、圖5同。

碳源是細胞生長和新陳代謝必需的營養物質,其種類和濃度直接影響芽孢的形成速率和產量。王天云等[16]探討培養基成分對乳酸芽孢桿菌芽孢形成的影響時,發現碳源濃度是影響乳酸芽孢桿菌芽孢形成的關鍵因素。Osadchaya等[17]通過豐富芽孢培養基碳源的組成,使細胞和芽孢產量較單一碳源時有了顯著提高。本試驗發現葡萄糖對酸土脂環酸芽孢桿菌的營養菌體生長和芽孢形成具有顯著的促進作用,當其濃度達到2 g/L時,即可有效地提高菌體總數和芽孢形成率。

2.3 氮源濃度對酸土脂環酸芽孢桿菌生長及芽孢形成的影響

由圖4A可知,當培養液中不含酵母浸粉而以(NH4)2SO4為唯一氮源時,45 ℃,250 r/min振蕩培養24 h,菌體總數為6.61 lg cfu/mL,芽孢數為6.53 lg cfu/mL,芽孢形成率為82.54%。當酵母浸粉添加濃度為1 g/L時,菌體總數增加至7.70 lg cfu/mL,芽孢數增加至7.68 lg cfu/mL,芽孢形成率由82.54%提高到95.41%。繼續增加酵母浸粉的濃度,菌體總數和芽孢數均不再隨酵母浸粉濃度的提高而明顯增加。當培養基中酵母浸粉的添加量為2～4 g/L時,菌體總數分別為7.66、7.63和7.63 lg cfu/mL,芽孢數分別為7.64、7.61和7.62 lg cfu/mL。研究表明,培養基中的氮源也是影響芽孢形成的因素之一[18],方差分析結果表明，酵母浸粉作為唯一有機氮源，對酸土脂環酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成具有顯著的影響(p<0.05),而無機氮源(NH4)2SO4對菌體生長和芽孢形成在p<0.05水平上影響不顯著(圖4B)。即使培養基中不含(NH4)2SO4，而以酵母浸粉為唯一碳源時,菌體總數仍高達7.69 lg cfu/mL,芽孢數達7.67 lg cfu/mL,而且增加(NH4)2SO4的添加濃度,菌體總數和芽孢數均無增加趨勢。

圖4 酵母浸粉和(NH4)2SO4 對Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T菌體生長和芽孢產量的影響Fig.4 Effects of yeast extract and(NH4)2SO4 concentrations on cell growth and spores production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

一般來講,有機氮源營養豐富,比無機氮源更有利于營養菌體生長,但是對細菌芽孢形成的影響并不清楚。作為革蘭氏陽性菌的模式菌株,枯草芽孢桿菌B68在以無機氮為唯一氮源時，生長較弱,在有機氮源中長勢較好[19]。酸土脂環酸芽孢桿菌對有機氮源的利用也明顯高于無機氮源,在以酵母浸粉為唯一氮源時,比以(NH4)2SO4為唯一氮源時所得的菌體總數提高了11.02倍,芽孢數提高了12.81倍,芽孢形成率提高了12.96%。

2.4 無機鹽對酸土脂環酸芽孢桿菌生長及芽孢形成的影響

AAM培養液中的無機鹽成分為CaCl2、KH2PO4、MnSO4·H2O、MgSO4·7H2O,各種無機鹽離子對酸土脂環酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成的影響如圖5所示。方差分析結果表明，Ca2+和K+濃度對菌體生長及芽孢形成的影響均不顯著(p>0.05),即使培養液中不含Ca2+或K+,菌體總數也達到7.59 lg cfu/mL,芽孢數達到7.49 lg cfu/mL,芽孢形成率為80.51%(圖5A、5B)。研究認為,在芽孢形成過程中,母細胞中產生的PDA與Ca2+結合形成Ca2+-DPA復合物,貯存在芽孢核中,在降低芽孢核含水量、增強芽孢耐熱性方面起著重要的作用[20]。金華等[21]研究發現,當溶液中含有較高濃度的鈣離子時,丁酸梭狀芽孢桿菌形成的芽孢數量較多,培養基中CaCl2濃度為0.8 g/L時,菌體數量和芽孢形成率均獲得最大值。陳秋紅等[22]研究發現,培養基中添加K2HPO4后凝結芽孢桿菌的菌體數量、芽孢數量和芽孢形成率均有所提高,表明K+對凝結芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成有促進作用。在本試驗中,培養液中單一缺乏Ca2+和K+，對酸土脂環酸芽孢桿菌的菌體生長和芽孢形成均無顯著影響,增大CaCl2和KH2PO4的添加濃度對該菌的菌體生長和芽孢形成也沒有顯著的促進作用。酸土脂環酸芽孢桿菌具有嗜酸耐熱的雙重生理特性,其芽孢具有更強的耐熱耐酸等抗逆特性,參與其芽孢形成過程的必需離子是否與其他種屬的微生物不同，仍需進一步的研究。

由圖5C可知,培養液中Mn2+濃度對酸土脂環酸芽孢桿菌菌體生長及芽孢形成的影響顯著(p<0.05)。培養液中不含Mn2+時,菌體總數為7.58 lg cfu/mL,芽孢數為7.49 lg cfu/mL,芽孢形成率為80.25%。Mn2+添加濃度較低時(0.24～0.48 g/L),對菌體生長和芽孢形成有一定的促進作用,繼續增加Mn2+的添加濃度,菌體總數和芽孢數均呈下降趨勢,當Mn2+濃度達到0.96 g/L時,菌體總數僅為4.03 lg cfu/mL。結果表明,一定濃度的Mn2+可以促進酸土脂環酸芽孢桿菌的營養菌體生長和芽孢形成,高濃度Mn2+反而抑制其菌體生長。這與文獻報道的Mn2+含量達到某一域值時，將會抑制菌體生長的結論相一致[23]。而在此Mn2+濃度下,芽孢數為4.00 lg cfu/mL,芽孢形成率高達96%,可見高Mn2+濃度對其菌體生長有明顯的抑制作用,但卻促進了芽孢形成。據報道,多種金屬離子可以促進細菌芽孢的形成[24]。Mn2+作為一種微生物生長所需的微量元素是超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖異構酶等許多酶的輔助因子,與碳水化合物的代謝有密切關系,影響細胞的生長和芽孢的形成[18],已有研究表明,金屬離子Mn2+能促進芽孢產生,提高芽孢得率[22,25-26],本研究也得到了同樣的結論。

圖5 CaCl2、KH2PO4、MnSO4、MgSO4濃度對酸土脂環酸芽孢桿菌DSM 3922T菌體生長和芽孢形成的影響Fig.5 Effects of CaCl2,KH2PO4,MnSO4 and MgSO4 concentrations on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

由圖5D可以看出,Mg2+對酸土脂環酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成的有顯著的影響(p<0.05),增加Mg2+濃度可以顯著提高酸土脂環酸芽孢桿菌的菌體總數、芽孢數和芽孢形成率。在Mg2+的添加濃度為0～0.34 g/L的范圍內,菌體總數隨Mg2+濃度的增加而增加。當Mg2+濃度為0.34 g/L時,與不含Mg2+的對照組相比,菌體總數從3.72 lg cfu/mL增加到7.66 lg cfu/mL,芽孢數從3.18 lg cfu/mL增加到7.64 lg cfu/mL,芽孢形成率也由29.31%上升到95.80%。繼續增加Mg2+濃度,菌體總數沒有顯著變化,芽孢數略有降低,可見高濃度Mg2+對酸土脂環酸芽孢桿菌菌體生長和芽孢形成沒有明顯的抑制效果。姚露燕等[27]發現,一定濃度的Mg2+對枯草桿菌BS-MM03的菌體生長及芽孢形成均有顯著的促進作用,但當Mg2+濃度大于0.03%時,菌體總量和芽孢形成率均下降。另有文獻報道,對于納豆芽孢桿菌,Mg2+有利于其菌體生長但不利于其芽孢的行成[28],而對丁酸梭狀芽孢桿菌,增加Mg2+濃度對其菌體生長沒有明顯的促進作用,但能促進其芽孢形成[21]。這些研究表明,Mg2+對不同微生物的菌體生長和芽孢形成有著不同的影響。Kolodziej 和Slepecky[29]推測,Mg2+是作為芽孢轉化過程中關鍵酶的輔助組分而起作用,其對不同微生物芽孢形成的影響機理尚待進一步研究。

2.5 不顯著因素交互作用對芽孢形成的影響

表2 不顯著營養因子的交互作用 對Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T菌體生長和芽孢形成的影響Table 2 Effects of interaction of two non-significant nutritional factors on cell growth and spore production of Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922T

3 結論