水蛭素的分離純化研究進(jìn)展

于曉敏 孟天嬌 崔慶本??

摘 要： 水蛭素（Hirudin）是水蛭唾液腺分泌物中的一種蛋白，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的天然凝血酶特效抑制劑，具有活血化淤的作用。但水蛭軀體中存在無(wú)抗凝活性的偽水蛭素組分和分泌物中大量成分復(fù)雜的物質(zhì)，增加了水蛭素分離純化難度；臨床運(yùn)用對(duì)生物制品的純度要求高，世界各地很多科學(xué)家對(duì)水蛭素的提取和純化做了許多相關(guān)的研究。本文對(duì)水蛭素分離純化方法進(jìn)行了綜述，比較了多種方法的優(yōu)勢(shì)與不足，為其分離純化工藝的進(jìn)一步優(yōu)化提供參考。

關(guān)鍵詞： 水蛭素；分離；純化；

【中圖分類號(hào)】 R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】 2236-1879（2018）11-0256-01

水蛭是傳統(tǒng)的中藥材，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就有記載，具有破血、逐淤、通經(jīng)的功效。 水蛭中有效成分為水蛭素，是目前已知的一種高效的、特異的、最強(qiáng)的凝血酶抑制劑水蛭素具有抗凝血和溶解血栓的作用，在治療心腦血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化、敗血休克、高血壓及缺少抗凝血酶Ⅲ因子的疾病等方面具有巨大的優(yōu)越性和廣闊的應(yīng)用前景。

1水蛭素的理化性質(zhì)

水蛭素干燥狀態(tài)下穩(wěn)定，室溫下水中可穩(wěn)定存在6個(gè)月，80℃下加熱15min而不被破壞。PH值升高或降低均會(huì)導(dǎo)致穩(wěn)定性下降，在0.1mol/L鹽酸溶液或0.1mol/L氫氧化鈉溶液中可穩(wěn)定15min。水蛭素不能被胰蛋白酶水解，對(duì)α-糜蛋白酶也有一定的耐受性，其原因在于水蛭素存在一個(gè)由3個(gè)二硫鍵組成的不易被降解的N-端結(jié)構(gòu)。但番木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶A則可使之失去活性。

2 水蛭素的分離與純化

2.1. 天然水蛭素的分離與純化。

天然水蛭素產(chǎn)生于水蛭的唾液里， 水蛭吸血時(shí)被分泌出來(lái)。楊潼等使水蛭充分饑餓，采取一種特殊的技術(shù)從活體水蛭中提取唾液腺分泌物。黃仁槐等采取擠壓的方法獲取水蛭嗦囊內(nèi)消化液。這些方式可以獲得活性很高的粗體液，但是處理較為繁瑣，效率很低。大多數(shù)研究均摘取水蛭頭部進(jìn)行勻漿處理，用丙酮、 乙醇或水提取。劉欣[1]等采用乙醇提取的方法，進(jìn)行水蛭素提取，以水蛭素體積活力為指標(biāo)，優(yōu)化乙醇提取的條件。劉洋等利用丙酮對(duì)醫(yī)用水蛭勻漿液進(jìn)行提取水蛭素粗品[2]，張彬等采用鹽浸提法、丙酮浸提法、醇浸提法進(jìn)行粗提，結(jié)果表明，丙酮提取具有更高的得率[3]。丙酮沉淀法必須嚴(yán)格控制溫度，否則很容易造成水蛭素失活。覃裕永[4]使用乙醇和丙酮分次提取，真空回收溶劑后合并濾液進(jìn)行真空冷凍干燥，發(fā)明工藝簡(jiǎn)單、成本低廉，收率較高、產(chǎn)品質(zhì)量好、保存期長(zhǎng)。目前研究水蛭素分離純化的方法很多，主要涉及到粗提純和精制兩個(gè)步驟。

2.1.1粗提

2.1.1.1 PH沉淀法：將水蛭素粗提液25 m L加入四倍體積即100mL 0.9%的Na Cl溶液稀釋，攪拌20min：用15%的三氯醋酸溶液調(diào)p H值至2.5，于66.7℃保溫30 min（適當(dāng)攪拌）后，4℃5×103r/min離心15min，收集上清液；再用l mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，4℃ 5x103r/min離心10rain，上清液即為粗提液，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和水蛭素活性，同時(shí)計(jì)算蛋白質(zhì)回收率、活性回收率、純化倍數(shù)和比活。得蛋白質(zhì)回收率為45.58%，活性回收率為55.55%，純化倍數(shù)為1.22，比活為6.41 AT-U/rag，得到的水蛭素粗提液雖然比較澄清，但其純化倍數(shù)相對(duì)而言較低，原因可能是這種方法采用加入較大體積的Na Cl溶液，提供一個(gè)溫和的環(huán)境造成的溶液過(guò)稀，造成需要進(jìn)一步的處理才能得到更好的濃度；

2.1.1.2有機(jī)溶劑沉淀法：取水蛭素唾液腺分泌物10 m L，用4倍體積即40 m L含水15%的冷丙酮溶液沉淀（含水15%的冷丙酮溶液預(yù)先配制好，放冰箱中預(yù)冷保存）用玻璃棒輕輕攪拌冷丙酮溶液和水蛭素唾液腺分泌物的混合物，存放在冰箱中過(guò)夜。將混合物在5x103 r/min下離心15min，濾去上清液部分，收集沉淀，然后用15%的20 m L三氯乙酸溶液溶解，再次在5x103r/rain下離心5 rain，去除不溶解的物質(zhì)，收集上清液，分別測(cè)定蛋白質(zhì)含量和水蛭素活性，同時(shí)計(jì)算蛋白質(zhì)回收率、活性回收率、純化倍數(shù)和比活。得蛋白質(zhì)回收率為18.70%，活性回收率為33.34%，純化倍數(shù)為1.78，比活為4.71AT-U/mg，通過(guò)添加丙酮來(lái)達(dá)到沉淀的目的，但是同時(shí)給測(cè)定活性造成的了很大的困難，要求低溫操作使操作過(guò)程容易引起目標(biāo)蛋自失活；

2.1.2 精制

2.1.2.1離子交換層析法：用磷酸鹽緩沖液平衡離子交換層析柱，取10ml粗提液進(jìn)樣，用起始緩沖液充分流洗，再以0—1.0 mol/L Na Cl梯度洗脫，收集速度為10 min/管， ，自動(dòng)收集后，每隔3管（O.5 h）測(cè)定活性一次，根據(jù)所測(cè)的結(jié)果，收集活性峰，經(jīng)透析濃縮后再測(cè)定活性峰的蛋白質(zhì)含量和活性。

結(jié)果表明，利用DEAE SephadexA-50和DEAESepharoseCL-6B樹(shù)脂對(duì)水蛭素粗提液進(jìn)行離子交換層析，經(jīng)過(guò)DEAE Sephadex A一50柱層析得到的水蛭素比活性僅達(dá)到15.9AT-U/mg水蛭素，純化倍數(shù)不到3，同時(shí)回收率也不高；但是經(jīng)過(guò)DEAE Sepharosc CL-6B柱層析所得到的水蛭素比活性能達(dá)到100AT-U/mg水蛭素以上，純化倍數(shù)也接近20，活性回收率較高?？芍狣EAE Sepharose CL-6B柱層析的分離效果和產(chǎn)物理想程度比DEAESephadexA-50柱層析要好。

2.1.2.2凝膠過(guò)濾層析法：經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B柱層析后的水蛭素溶液3mL上樣，經(jīng)Sephadex G.25柱層析后，收集有效峰后，經(jīng)濃縮再測(cè)定其蛋白質(zhì)含量和活性。用此法進(jìn)行脫鹽，效果最好，規(guī)律性較強(qiáng)，同時(shí)隨著洗脫速度的增加，所需的洗脫時(shí)間越來(lái)越短。用30 m L/h的流速進(jìn)行脫鹽的效果最好，其收集液比活為1017AT-U/mg，蛋白質(zhì)回收率為7.22%，活性回收率為63%，純化倍數(shù)為8.73。

參考文獻(xiàn)

[1] 劉欣， 張文清， 夏瑋，等. 提取水蛭有效成分初探[J]. 中成藥， 2002， 24（11）：894-895.

[2] 劉洋， 崔紅. 水蛭素的分離與純化[J]. 牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2004， 25（2）：35-36.

[3] 張彬， 汪波， 龔元，等. 幾種水蛭抗凝血物質(zhì)提取及活性分析[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2012， 51（4）：92-96.

[4] 覃裕永. 一種天然水蛭素有效成分的提取方法： CN， CN 101108879 A[P]. 2008.