兩色金雞菊水提液微生物限度檢查法實驗研究

劉宏 張穎

摘要：驗證藥典中常規方法檢測兩色金雞菊水提液中微生物限度的可行性，按照藥典規定的微生物限度檢查法對兩色金雞菊水提液中的菌數計數和控制菌進行檢測，菌數計數結果各試驗菌回收率均大于70%，控制菌檢查實驗組均陽性檢出。結果表明實驗所采取的薄膜過濾法計數和控制菌檢查常規方法能正確反映檢品中微生物限度的情況，適合于兩色金雞菊水提液微生物限度檢查。

關鍵詞：微生物限度；兩色金雞菊

兩色金雞菊（CoreopsistinctoriaNutt）又名血菊，維吾爾語稱“古麗恰爾”，系菊科金雞屬一年生草本植物兩色金雞菊的干燥花蕾。具有活血化瘀、清熱解毒、和胃健脾之功效。[1]現代研究表明，兩色金雞菊含有黃酮、皂苷、多糖、揮發油、氨基酸等成分，具有降血脂、降血壓，抗衰老、降糖等藥理作用。[2，3]本文對兩色金雞菊藥材的微生物限度檢查方法進行了探討和研究，按照2015年藥典相關規定進行方法學驗證，為完善兩色金雞菊藥材檢測方法和微生物限度方法學探討提供有益的科學探討。

1材料與方法

1.1儀器與材料

MJX250型恒溫培養箱由上海博迅醫療設備廠生產；蒸汽壓力滅菌器由上海申安醫療設備廠生產；旋渦混合器由浙江麒麟醫藥設備有限公司生產；過濾器由蜀牛玻璃制品有限公司生產。枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、大腸埃希菌[CMCC（F）44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]購自中國藥品生物制品鑒定所；實驗所用培養基購自廣東環凱微生物科技有限公司。兩色金雞菊藥材產自新疆，購自新疆采薇飄香電子商務有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌液的制備

菌種經復蘇后細菌移至營養瓊脂培養基置培養箱中30～35℃培養24h，取新鮮培養物加0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升含菌數為50～100cfu的菌懸液；真菌移至改良馬丁瓊脂培養基置培養箱中20～25℃培養7d，取新鮮培養物加0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升含菌數為50～100cfu的菌懸液。

1.2.2供試品溶液的制備

取供試品10g，加純化水100ml，超聲30min后過濾，濾液補足至100ml備用。

1.2.3薄膜過濾法菌數計數檢查

采用藥典規定薄膜過濾法進行菌數計數。實驗組取供試品溶液1ml加無菌蛋白胨溶液至100ml，用過濾器薄膜過濾，蛋白胨溶液沖洗濾膜2次，每次100ml，在最后一次沖洗液中加入1ml含50～100cfu的菌液，取下濾膜置于規定培養基中在規定溫度下培養至規定時間，點計菌落數；菌液組為考察實驗組中加入的菌液中具體菌數，過濾器僅薄膜過濾與實驗組相同量的菌液，其余操作過程同實驗組；供試品對照組考察供試品中所含菌數過濾器僅薄膜過濾與實驗組相同量的供試品溶液，其余操作過程同實驗組。回收率按照1.2.4項下計算，結果如表1所示。

1.2.4回收率計算

加菌回收率=（實驗組的平均菌落數供試品對照組的平均菌落數）/菌液組的平均菌落數*100%

1.2.5控制菌檢查（大腸埃希菌和沙門菌）

取膽鹽乳糖培養基3份，其中一份接種大腸埃希菌作為陽性對照，一份無添加為陰性對照，一份接種供試品溶液作為實驗組，35℃培養24h后取菌液0.2ml進行MUGI實驗，最后劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，觀察菌落形態。

取營養肉湯培養基3份，同大腸埃希菌設置陰性和陽性對照以及實驗組，35℃培養24h后增菌培養，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平板上，培養后觀察菌落形態，隨后劃線TSI瓊脂鞋面觀察顏色特征，最后取斜面培養物進行生化試驗確認。結果如表2所示。

2實驗結果

2.1菌數計數實驗結果

由表1可以看出，所有試驗菌回收率均大于藥典規定的70%，說明兩色金雞菊水提取液對所有試驗菌均無明顯抑制反應，不影響菌數計數過程。

2.2控制菌檢查實驗結果

表2可以看出控制菌檢查結果PC和NC結果均正常，實驗組均為陽性檢出，符合藥典中對于控制菌檢查的要求。

綜上，兩色金雞菊水提液對菌數計數和控制菌檢查均無影響，藥典規定的常規實驗方法適合兩色金雞菊水提液的微生物限度檢查技術。

3討論

藥物的微生物限度檢定工作常因藥物對微生物生長的抑制作用而無法準確表現藥物被微生物污染的情況，所以在方法學驗證在前期實驗方法的確定過程中具有十分重要的意義。兩色金雞菊是規范化生產相對較新的藥物，在微生物限度檢查方面的研究較少，本文驗證了藥典中常規方法對兩色金雞菊藥物水提液微生物限度檢查的適合程度，因無明顯的抑制微生物生長作用，故而常規實驗方法可真實表現兩色金雞菊水提液中微生物污染程度，為該藥物的規范化檢查提供有益的科學探討。

參考文獻：

[1]張邦能，舒暢，杜玫，等.昆侖雪菊水提物對2型糖尿病小鼠血糖及胰島素水平的影響[J].西部中醫藥，2016，29（1）：2629.

[2]梁淑紅，龐市賓，劉曉燕，等.金雞菊提取物降血脂作用的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2010，16（8）：234235.

[3]張淑鵬，李琳琳，木合布力·阿布力孜，等.昆侖雪菊提取物對α葡萄糖苷酶的抑制作用[J].現代生物醫學進展，2011，11（6）：10551058.

項目：省級優秀青年人才支持計劃兩色金雞菊化學成分及其降“三高”物質基礎研究（gxyqZD2016505）省級創新發展行動計劃藥品生物檢定技術精品在線開放課程