藏藥鐵棒錘及其習用品中3種生物堿含量測定

趙梅宇 宋良科 任瑤瑤 譚睿

摘要：目的 建立同時測定鐵棒錘及其習用品中苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿的HPLC含量測定方法，為鐵棒錘藥材質量標準毒性成分控制及其與習用品區別提供依據。方法 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸），梯度洗脫，檢測波長235 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃。結果 苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿分離度良好，3種成分在檢測范圍內均呈良好線性（r>0.999），平均加樣回收率為97.66%～98.47%，RSD為0.84%～1.60%。結論 鐵棒錘及其習用品中3種生物堿的含量差異較大，多裂烏頭A. polyschistum、縮梗烏頭A. sessiliflorum應另立藥名加以區別。

關鍵詞：鐵棒錘；多裂烏頭；縮梗烏頭；生物堿；含量測定

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.020

中圖分類號：R284.1 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0083-04

Abstract： Objective To establish a method for determining benzoylaconine， aconitine and 3-deoxyaconitine in Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials by HPLC； To provide basis for control of quality standard toxicity composition in Aconitum pendulum and difference between Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials. Methods Agilent Eclipse XDB-C18 column （250 mm × 4.6 mm，5 μm） was used at 25 ℃ with the mobile phase consisting of acetonitrile-0.04% trimethylamine （each 1000 mL of water plus 4 mL triethylamine and 1.68 mL phosphoric acid） by gradient elution； detection wavelength was 235 nm； the flow rate was 1 mL/min； injection volume was 10 μL. Results The benzoylaconine， aconitine and 3-deoxyaconitine had good separation and linear relationship in the corresponding range （r>0.999）. The average recovery rates were 97.66%–98.47%， and RSD were 0.84%–1.60%. Conclusion The contents of 3 alkaloid were different in Aconitum pendulum and the habitually medicinal materials. Both A. polyschistum and A. sessiliflorum need separate drug names.

Keywords： Aconitum pendulum； A. polyschistum； A. sessiliflorum； alkaloid； content determination

榜那（Radix Aconiti）始載于藏醫學巨著《四部醫典》[1]，其味甘、微苦，性熱，有大毒，具有驅寒止痛、祛風定驚功效，用于治療龍病、寒病、黃水病、麻風、癲狂等。1987年版《四川中藥材標準》[2]收載藥材雪上一支蒿，別名鐵棒錘、鐵棒七、三轉半：為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘Aconitum pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum、多裂烏頭A. polyschistum的干燥根。

1995年版《衛生部藥品標準·藏藥》（第一冊）[3]收載藥材鐵棒錘，藏藥名為榜那，為毛茛科植物鐵棒錘A. pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum的干燥根。1997年，《中華藏本草》[4]收載藏藥材曼欽-鐵棒錘，為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘A. pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum及多裂烏頭A. polyschistum等多種同屬植物的干燥根。2010年版《四川中藥材標準》[5]因《衛生部藥品標準·藏藥》已收載鐵棒錘，不再收載藥材雪上一支蒿（鐵棒錘）。因多裂烏頭A. polyschistum和縮梗烏頭A. sessiliflorum在四川阿壩等藏區已長期作鐵棒錘藥用，而多裂烏頭藥用效果好，一直受到青睞。近10多年來，四川阿壩洲馬爾康、若爾蓋等縣大量引種栽培多裂烏頭A. polyschistum，并作鐵棒錘銷售。根據鐵棒錘藥效成分（也是毒性成分）主要為烏頭堿、3-脫氧烏頭堿、3-乙酰烏頭堿、苯甲酰烏頭堿等[6-7]的特點，本研究建立HPLC分析方法，對比鐵棒錘及其習用品中生物堿的種類和含量，為鐵棒錘質量控制和其習用品多裂烏頭、縮梗烏頭的資源合理利用提供依據。

1 儀器與試藥

Agilent1260-II型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），BS-110S型電子分析天平（北京賽多利斯電子天平有限公司），KQ-500DE型數控超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）。

苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿（成都普思生物生物科技有限公司，批號分別為PS010300、PS0150-0025、PS13031302，含量≥98%），甲醇、乙腈為色譜純（Sigma），其他試劑均為分析純。

藥材樣品經西南交通大學宋良科教授鑒定為毛茛科烏頭屬植物鐵棒錘（編號1～6），多裂烏頭（編號7～9）、縮梗烏頭（編號10、11），見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸），梯度洗脫（0～15 min，25%～30%乙腈；15～25 min，30%～40%乙腈；25～45 min，40%～60%乙腈），檢測波長235 nm，流速1 mL/min，進樣量10 μL，柱溫25 ℃。在上述色譜條件下，供試品中苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿色譜峰保留時間與對照品一致，3個成分的色譜峰能達到較好分離，樣品其他成分對待測成分的測定無干擾。各成分吸收峰理論塔板數均不低于4000，色譜峰分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取苯甲酰烏頭堿3.03 mg、烏頭堿12.17 mg、3-脫氧烏頭堿3.89 mg，分別置于10 mL容量瓶中，分別加甲醇溶解并定容，搖勻。依次分別精密吸取上述對照品溶液各1 mL于同一5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，制成每1 mL分別含苯甲酰烏頭堿0.060 6 mg、烏頭堿0.243 4 mg、3-脫氧烏頭堿0.077 8 mg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取鐵棒錘粉末（過2號篩）約2 g，精密稱定，置錐形瓶中，加3 mL氨水，精密加入50 mL乙酸乙酯-異丙醇（1∶1），稱定質量，超聲處理（300 W，40 kHz，25 ℃以下）30 min，放冷，用乙酸乙酯-異丙醇（1∶1）混合溶液補足減失的質量，搖勻，過濾，精密量取續濾液25 mL，40 ℃以下減壓回收溶劑至干，殘渣精密加入甲醇5 mL，溶解，過濾，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察

精密吸取混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項下色譜條件，測定峰面積，以進樣量（mg）為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程和相關系數。結果表明3種生物堿在相應范圍內關系良好，見表2。

2.5 精密度試驗

精密吸取同一混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，計算RSD。結果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿峰面積的RSD分別為1.94%、2.32%、1.67%，表明儀器精密度較好。

2.6 穩定性試驗

精密稱取鐵棒錘樣品約2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，于制備后0、3、6、9、18、24 h進樣，測定峰面積，計算RSD。結果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿峰面積的RSD分別為2.15%、2.07%、1.51%，表明供試品溶液在24 h內穩定可用。

2.7 重復性試驗

精密稱取1號鐵棒錘樣品6份，每份約2 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測定峰面積，計算RSD。結果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿峰面積的RSD分別為1.27%、1.34%、2.67%，表明本試驗重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱定1號鐵棒錘樣品6份，每份約0.8 g，分別精密加入1 mL對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，計算加樣回收率。結果苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿的平均回收率分別為97.66%、98.41%、98.47%，RSD分別為1.60%、1.29%、0.84%，見表3～表5。

2.9 樣品含量測定

精密稱取各藥材粉末，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算各樣品中3種成分含量，每個樣品平行試驗3份，結果見表6。

3 討論

本研究在文獻[8-10]對比及本課題組前期研究基礎上，將流動相優化為乙腈-0.04%三乙胺（每1000 mL水加4 mL三乙胺、1.68 mL磷酸）進行梯度洗脫，使各成分達到理想的分離，可同時測定鐵棒錘中苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿的含量，具有簡便、準確、重復性好的特點。該方法為鐵棒錘指紋圖譜的建立和藥材質量控制奠定了良好基礎。

苯甲酰烏頭堿、烏頭堿、3-脫氧烏頭堿為鐵棒錘Aconitum pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum及其習用品多裂烏頭A. polyschistum、縮梗烏頭A. sessiliflorum的共有成分。本研究結果表明，多裂烏頭的烏頭堿平均含量為鐵棒錘的1.4倍，而3-脫氧烏頭堿的平均含量為鐵棒錘的2.6倍，僅苯甲酰烏頭堿的含量低于鐵棒錘。苯甲酰型生物堿毒性為雙酯型烏頭堿的1/1500～1/150[11]，可見多裂烏頭毒性（藥用成分）遠高于鐵棒錘，又因多裂烏頭A. polyschistum在四川阿壩藏區藥用歷史悠久，并取名三轉半（藥材在碗底研磨以此限量）是有藥效物質基礎為依據的，應另立藥物名稱為鐵棒七或三轉半，收入藥材標準，解決資源利用問題。

縮梗烏頭的烏頭堿平均含量僅為鐵棒錘的0.28倍，且3-脫氧烏頭堿的含量不及鐵棒錘的1/3，僅苯甲酰烏頭堿的含量約為鐵棒錘的1.4倍，由于單酯型烏頭堿毒性遠低于雙酯型烏頭堿，故縮梗烏頭的毒性遠低于鐵棒錘，不宜作鐵棒錘或雪上一枝蒿藥用。

本研究前期對鐵棒錘的名稱與基源考證認為：榜那-鐵棒錘藥材（雪上一枝蒿）涉及毛茛科烏頭屬16種基源植物的塊根；在藏、漢居住地或漢、藏混居區均有分布的鐵棒錘A. pendulum、伏毛鐵棒錘A. flavum、多裂烏頭A. polyschistum為藥用主流品種。目前各級藥材標準均未收載多裂烏頭A. polyschistum而使其淪為鐵棒錘和雪上一枝蒿的偽品；藥農不能出售，藥廠不能購買。本研究結果表明，鐵棒錘、多裂烏頭、縮梗烏頭主要藥效成分種類基本一致，多裂烏頭的雙酯型烏頭堿成分含量比鐵棒錘高，毒性更大，但驅寒止痛、祛風定驚效果更好，不應廢棄，而應另立藥物名稱收入標準。縮梗烏頭A. sessiliflorum又名雪上一支蒿，各級藥材標準也未收載，其單酯型烏頭堿比鐵棒錘含量高，雙酯型烏頭堿含量更低，安全性比鐵棒錘高，可進一步研究，作口服藥材使用。

參考文獻：

[1] 青海省藏醫藥研究所，《藏醫藥經典文獻集成》編委會.扎塘版四部醫典[M].北京：民族出版社，2005：569，695.

[2] 四川省衛生廳.四川中藥材標準[M].成都：四川科學技術出版社，1987：234-235.

[3] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.中華人民共和國衛生部藥品標準：藏藥（第一冊）[M].北京：人民衛生出版社，1995：79-80.

[4] 羅達尚.中華藏本草[M].北京：民族出版社，1997：62-63.

[5] 四川省食品藥品監督管理局.四川省中藥材標準[M].成都：四川科學技術出版社，2010：Ⅳ.

[6] 張帆，武琳，哈木拉提·吾甫爾.民族藥鐵棒錘炮制前后烏頭堿和3-脫氧烏頭堿含量的HPLC分析[J].中成藥，2011，33（3）：479-482.

[7] 王毓杰，曾陳娟，姚喆，等.鐵棒錘及其炮制品中二萜生物堿化學成分研究[J].中草藥，2010，41（3）：347-351.

[8] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：39.

[9] 萬萌萌，時曉媞，譚睿.毛茛科植物鐵棒錘與工布烏頭的對比研究[J].中國藥師，2016，19（9）：1633-1635.

[10] 王毓杰，曾陳娟，姚喆，等.民族藥鐵棒錘不同藥用部位中生物堿含量測定[J].中成藥，2010，32（8）：1390-1393.

[11] 陳樹和.烏頭類中藥炮制歷史沿革及發展概況[J].湖北中醫雜志， 2017，39（11）：58-61.